酵素による難分解性ポリマーの分解・除去・加工技術の開発

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24380055
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 金谷 茂則 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (30273585)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: クチナーゼ / 飽和変異 / ポリエステル / サチライシン / プリオン / カルシウム結合部位 / メタゲノム / セルラーゼ

研究実績の概要

（１）LC-cutinaseの高活性化と安定化：LC-cutinaseの基質結合部位を形成するTrp190、Val212、Phe243に同時に飽和変異を導入し、活性を示す変異体をスクリーニングした。その結果、LC-cutinaseが活性を示すためには190番目のアミノ酸はTrp、Tyr、Pheなどの芳香族アミノ酸でなければならないこと、212番目のアミノ酸はVal、Leu、Ileなどの長鎖脂肪族アミノ酸であるのが望ましいことを明らかにした。
（２）LC-cutinaseによるポリエステルの表面加工：染色加工試験用ポリエステル白布をLC-cutinaseで処理した後、電子顕微鏡により線維表面を観察した結果、LC-cutinaseにより繊維表面のPETオリゴマーが除去され、繊維表面がきれいになることが分かった。
（３）Tk-SPの高活性化と安定化：Tk-SPのCa2サイトにAsp474→Alaの変異を導入することにより、Tk-SPの活性は変化しないがEDTA存在下における安定性が大きく向上することを明らかにした。
（４）Tk-subtilisinによる異常プリオン分解機構の解析：プリオン病に感染したマウス脳ホモジネートをプロテアーゼで処理し、その培養細胞（N2aC24 cell）感染性を調べることにより、プロテイナーゼKで処理するよりTk-subtilisinで処理する方が感染性は低下することを明らかいした。
（５）コンポスト由来新規セルラーゼの構造と機能の解析：枝葉コンポストからメタゲノム法により単離した１０種類の新規セルラーゼのうち、N末端にflexible loop（FL）をもつLC-CelAとIg-likeドメインをもつLC-CelGの結晶構造を決定した。また、FLが安定性に寄与すること、Ig-likeドメインが安定性、活性、フォールディングに寄与することを明らかにした。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額が生じた理由

26年度が最終年度であるため、記入しない。

次年度使用額の使用計画

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Structural and biochemical characterization of a metagenome-derived esterase with a long N-terminal extension. (2015)
  • 著者名/発表者名: Okano, H., Hong, X.,, Kanaya, E., Angkawidjaja, C., and Kanaya, S.
  • 雑誌名: Protein Sci. 巻: 24 ページ: 93-1041
  • DOI: 10.1002/pro.2591
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure, activity and stability of metagenome-derived glycoside hydrolase family 9 endoglucanase with an N-terminal Ig-like domain. (2015)
  • 著者名/発表者名: Okano, H., Kanaya, E., Ozaki, M., Angkawidjaja, C., and Kanaya, S.
  • 雑誌名: Protein Sci. 巻: 24 ページ: 408-419
  • DOI: 10.1002/pro.2632
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enzymatic activities of RNase H domains of HIV-1 reverse transcriptase with substrate binding domains of bacterial RNases H1 and H2. (2015)
  • 著者名/発表者名: Permanasari, E.-D., Yasukawa, K., and Kanaya, S.
  • 雑誌名: Mol. Biotechnol. 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1007/s12033-015-9846-5
• [雑誌論文] Calcium-independent opening of lid1 of a family I.3 lipase by a single Asp to Arg mutation at the calcium-binding site. (2014)
  • 著者名/発表者名: Cheng, M., Angkawidjaja, C., Koga, Y., and Kanaya, S
  • 雑誌名: Protein Eng. Des. Sel. 巻: 27 ページ: 169-176
  • DOI: 10.1093/protein/gzu00
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural basis for salt-dependent folding of ribonuclease H1 from halophilic archaeon Halobacterium sp. NRC-1. (2014)
  • 著者名/発表者名: You, D.-J., Jongruja, N., Tannous, E., Angkawidjaja, C., Koga, Y., and Kanaya, S.
  • 雑誌名: J. Struct. Biol. 巻: 187 ページ: 119-128
  • DOI: 10.1016/j.jsb.2014.06.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Divalent metal ion-induced folding mechanism of RNase H1 from extreme halophilic archaeon Halobacterium sp. NRC-1. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tannous, E., and Kanaya, S.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 9 ページ: e109016
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0109016
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structure and stability of metagenome-derived glycoside hydrolase family 12 cellulase, LC-CelA, a homolog of Cel12A from Rhodothermus marinus. (2014)
  • 著者名/発表者名: Okano, H., Ozaki, M., Kanaya, E., Kim, J.-J., Angkawidjaja, C., Koga, Y., and Kanaya, S.
  • 雑誌名: FEBS Open Bio 巻: 4 ページ: 936-946
  • DOI: 10.1016/j.fob.2014.10.013
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Rational design of a glycosynthase by the crystal structure of β-galactosidase from Bacillus circulans (BgaC) and its use for the synthesis of N-acetyllactosamine type 1 glycan structures. (2014)
  • 著者名/発表者名: Henze, M., You, D.-J., Kamerke, C., Hoffmann, N., Angkawidjaja, C., Ernst, S., Pietruszka, J., Kanaya, S., and Elling, L.
  • 雑誌名: J. Biotechnol. 巻: 191 ページ: 78-85
  • DOI: 10.1016/j.jbiotec.2014.07.003
  • 査読あり
• [学会発表] Structure, activity and stability of metagenome-derived glycoside hydrolase family 9 endoglucanase with an N-terminal Ig-like domain (2015)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Okano, Eiko kanaya, Masashi Ozaki, Clement Angkawidjaja, and Shigenori Kanaya
  • 学会等名: JSPS Symposium “Biotechnology and Chemistry for Green Growth”
  • 発表場所: 千里ライフサイエンスセンター、大阪
  • 年月日: 2015-03-09 – 2015-03-11
• [学会発表] Crystal structure of glycoside hydrolase family 9 endoglucanase with an N-terminal Ig-like domain isolated from leaf-branch compost (2015)
  • 著者名/発表者名: Hiroyuki Okano, Eiko kanaya, Masashi Ozaki, Clement Angkawidjaja, Yuichi Koga, and Shigenori Kanaya
  • 学会等名: 59th Annual Meeting of Biophysical Society
  • 発表場所: ボルティモア、アメリカ
  • 年月日: 2015-02-07 – 2015-02-11
• [学会発表] Proteolysis of abnormal prion protein with a thermostable protease from a hyper-thermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis KOD1 (2015)
  • 著者名/発表者名: Yuichi Koga, Nami Shimizu, Akikazu Sakudo, and Shigenori Kanaya
  • 学会等名: 59th Annual Meeting of Biophysical Society
  • 発表場所: ボルティモア、アメリカ
  • 年月日: 2015-02-07 – 2015-02-11
• [学会発表] Secretion of metagenome-derived LC-cutinase with PET degrading activity to extracellular medium of E. coli cells (2014)
  • 著者名/発表者名: Sintawee Sulaiman, Eiko Kanaya, and Shigenori Kanaya
  • 学会等名: 6th Annual PEGS Europe
  • 発表場所: リスボン、ポルトガル
  • 年月日: 2014-11-03 – 2014-11-07
• [学会発表] 枝葉コンポストから単離したグリコシドヒドロラーゼファミリー12セルラーゼの結晶構造と熱安定化機構に関する研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 岡野啓志, 金谷栄子, 尾崎昌史, Angkawidjaja Clement, 古賀雄一, 金谷茂則
  • 学会等名: 第87回日本生化学会
  • 発表場所: 国立京都国際会館、京都
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] Ca2+結合部位の変異による超好熱菌由来セリンプロテアーゼTk-SPの安定化 (2014)
  • 著者名/発表者名: 三浦 明子、洪 遜、阿部 一勝、Tita Foophow、古賀 雄一、金谷 茂則
  • 学会等名: 第87回日本生化学会
  • 発表場所: 国立京都国際会館、京都
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] 超好熱菌由来プロテアーゼによるプリオン蛋白質分解の評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 清水七海, 古賀雄一, 作道章一, 原 英之, 坂口末廣, 金谷茂則
  • 学会等名: 第87回日本生化学会
  • 発表場所: 国立京都国際会館、京都
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] ベトナムDongNai 川流域のメタゲノムライブラリからの酵素探索 (2014)
  • 著者名/発表者名: 藤澤 裕紀、古賀 雄一、Le Phi Nga、金谷 茂則
  • 学会等名: 第87回日本生化学会
  • 発表場所: 国立京都国際会館、京都
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] 超好熱菌由来プロテアーゼによるプリオンタンパク質分解の評価 (2014)
  • 著者名/発表者名: 古賀雄一, 清水七海, 作道章一, 原 英之, 坂口末廣, 金谷茂則
  • 学会等名: 第66回日本生物工会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター、札幌
  • 年月日: 2014-09-09 – 2014-09-11