| 研究概要 |
A. SLRPs遺伝子の発現抑制実験
まずRT-PCRおよびRACE法を用いて,ゼブラフィッシュのデルマトポンチン,デコリン,ミメカンをターゲットとしてクローニングを開始した。その結果,デルマトポンチンは1種類のcDNA全長クローニングに成功した。また,デコリン,ミメカンは複数のアイソフォームがクローニングされた。すなわち,ミメカンにおいてデータベースに「ミメカン」および「オステオグリシン」として登録されている2種類の遺伝子がクローニングされた。さらに,デコリンおよびミメカンではORF部分は共通であるが,3'UTR部分の長さの異なる複数の遺伝子がクローニングされた。ウシにおいては,一つのミメカン遺伝子から大分子であるミメカンとその一部が切り離された小分子であるオステオグリシンが生成される。しかしウシとは異なり,ゼブラフィッシュではミメカンに2種類の遺伝子が存在するものと判定された(遺伝子の命名が混乱している事実も判明した)。また,1種類のゲノムから,3'UTRの長さが異なるmRNAが合成されることは,哺乳類のSLRPsにおいて頻繁に報告されている。本研究により,魚類のSLRPsにおいてはじめて同様の現象が発見されたことから,長さの異なる3'UTRをもつmRNAの発現は,広く脊椎動物全般のSLRPsに保存されたものであることが予想された。さらに,デルマトポンチンの遺伝子発現解析とノックダウン実験に成功し,ノックダウン個体では筋形成,眼の形成,塩類細胞の形成,脊索の伸張に異常が生じることを明らかにした。
B.リコンビナントタンパク質を用いたin vitroコラーゲン線維化実験
キンギョにおいてcDNAクローニングが終了した,デルマトポンチンおよびビグリカンを大腸菌で発現させることに成功した。デルマトポンチンに関しては精製に成功し,抗体を作成した。予備的な試験で,リコンビナントデルマトポンチンがin vitroにおいてコラーゲン線維形成を促進することを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
遺伝子クローニングは80%以上の達成度であると判定できる。リコンビナント合成に関しては予定していた大腸菌における発現に加え,次年度以降に予定していたデルマトポンチンの精製と抗体作成に成功したほか,線維化実験でも予備的データを得ることができたため,当初計画以上に進展していると判定できる。さらに,H27年度以降に予定していたノックダウン実験に成功した。これらを総合すると,計画全体としては当初の計画以上に進展していると判定できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
H24年度計画で進めることができなかった,デコリンおよびミメカン遺伝子の5'UTR領域のクローニングを終了させるほか,リコンビナントビグリカンの精製をおこなう。さらに,当初H25年度に計画していたとおり,SLRPs遺伝子の発現解析,リコンビナントタンパク質を用いたin vitroコラーゲン線維化実験,特異抗体の作成と免疫組織化法を用いたSLRPsの局在解析をおこなう。
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