| 研究課題/領域番号 |
24380111
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 独立行政法人水産総合研究センター |
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研究代表者 |
中村 洋路 独立行政法人水産総合研究センター, 中央水産研究所, 任期付研究員 (90463182)
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| 研究分担者 |
藤原 篤志 独立行政法人水産総合研究センター, 中央水産研究所, 主任研究員 (30443352)
安池 元重 独立行政法人水産総合研究センター, 中央水産研究所, 任期付研究員 (20604820)
中易 千早 独立行政法人水産総合研究センター, 増養殖研究所, グループ長 (00311225)
松山 知正 独立行政法人水産総合研究センター, 増養殖研究所, 主任研究員 (20372021)
高野 倫一 独立行政法人水産総合研究センター, 増養殖研究所, 研究員 (40533998)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 魚病 / バイオインフォマティクス / 免疫学 |
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| 研究概要 |
本年度では、はじめに養殖ヒラメ12個体を収集しゲノムDNAおよびcDNAを抽出した。cDNAは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)タンパク質が発現していると思われる脾臓、腎臓、白血球、腸の細胞から抽出した。また、これと並行してGenBankデータベースよりヒラメMHC領域の既知DNA配列を取得した。この配列情報より保存性の高い領域を検索し、すべてのヒラメMHCクラスIa配列、とくに抗原結合部位のDNA配列を選択的に増幅できるPCRプライマーを設計した。このプライマーを用いて、上記のヒラメ12個体および別の養殖ヒラメ14個体の各MHC配列を、cDNAアンプリコンタギング法と2種の次世代シーケンサー(Roche454FLx+およびPacBio)によって収集し、データベース化することができた。収集されたDNA配列に対してMHC遺伝子型の分類と頻度分析を行った結果、ヒラメは1個体あたり少なくとも8つのMHCクラスIa遺伝子座を持つことが推定された。これまでに報告された他の魚種と比べても非常に数が多いことから、ヒラメにおけるMHC遺伝子座の機能分化や進化を考える上で非常に興味深い新知見である。
MHCの抗原結合部位の立体構造予測およびドッキングシミュレーションについては、ヒラメMHCの立体構造が未知であるため、タンパク質構造データベース(PDB)から相同配列情報を取得することを試みた。
その結果、3種類のマウスMHC立体構造データ(PDBコード:1BII,1S7S,3ECB)を選別し、ホモロジーモデリング法によってヒラメMHC立体構造を推定した。また、ドッキングシミュレーションの条件検討として、マウスMHCの既知構造情報を用いてペプチドドッキングを行ったところ、1S7Sで良好な予測結果を得たため、これをヒラメMHCエピトープ予測用の鋳型構造とした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
おおむね予定通りにヒラメDNAおよびRNAサンプルを収集することができ、すべてのヒラメMHC遺伝子座に適用できるプライマーを設計することができた。これにより次世代シーケンサーを用いたMHCジェノタイピングがより効率的に進展するものと期待される。また、ヒラメMHCの遺伝子座数についてこれまでに報告されなかった新知見があり、学術的な達成も本年度で得られている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ドッキングシミュレーションの系を用いて、細胞内寄生細菌Edwatdsiella tardaの遺伝子配列を網羅的にスキャンし、エピトープ候補ペプチドを選別する。これらを用いてE.tatdaに対するヒラメの感染防御効果を測定する。またヒラメラブドウィルス(HIRRV)からも同様にエピトープ候補ペプチドを設計し、感染防御効果を評価する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
当初の予定では、実験補助員のための人件費とペプチド合成用の諸費用を計上していたが、本年度では実験補助の必要が無くなったので、次年度以降にペプチド合成をまとめて行うこととした。
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