| 研究課題/領域番号 |
24380150
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
麻生 久 東北大学, 農学研究科, 教授 (50241625)
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| 研究分担者 |
渡邊 康一 東北大学, 農学研究科, 助教 (80261494)
北澤 春樹 東北大学, 農学研究科, 准教授 (10204885)
岡田 夏美 東北大学, 農学研究科, 一般技術職員 (10621584)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | プリオン / M細胞 / aldolase A / 牛腸管上皮細胞株 / プロテオーム解析 / 輸送小胞 / 侵入 / 組織解析 |
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| 研究概要 |
本研究は、経口摂取プリオン蛋白の腸管M細胞を介した侵入機構と神経細胞への伝播機構の解明を目的する。構築した腸管上皮M細胞のプリオン蛋白取り込みに関わる蛋白を膜輸送蛋白複合体トランスポートゾームライブラリーより絞り込み、樹立したウシ腸管上皮細胞株のM細胞分化誘導系およびウシ神経細胞分化誘導系を用いて、本研究終了時までにはM細胞のプリオン蛋白取り込みに関わる蛋白の同定と神経細胞への伝播機構の解明を試みるものである。
今年度は、ウシ腸管上皮細胞株(BIE細胞)をM細胞に分化誘導させ、磁気ビーズあるいはウシPrP結合磁気ビーズを添加して培養を行い、磁気ビーズを含有する細胞内小胞を磁気スタンドにより回収し、2次元電気泳動を行い、特異的な発現と増加が確認されたスポットを切り出し、LC-MS/MS解析による膜輸送蛋白複合体トランスポートゾームライブラリーを構築した。ライブラリー蛋白を精査し、M細胞のプリオン蛋白の取り込みに関わる可能性が高く、特異的発現が認められる蛋白の選抜を試みた。その結果、sCJD患者とプリオン感染マウスの脳髄液で増加が確認され、神経細胞で発現しており、類似したAldolaseCがプリオン蛋白に親和性があることが報告されているFructose-bisphosphate aldolase A(解糖系酵素)に着目した。
同定したaldolaseAはウシ腸管M細胞に特異的に発現し、aldolaseAはマウス腸管M細胞においても特的に発現していることを発見した。Aldolase Aは、マウス神経細胞株(N2aC4細胞)で発現しており、マウスプリオン持続感染細胞株(N2aC24 L1-3細胞)においては、プリオン蛋白が検出される小胞でaldolase Aとプリオン蛋白が共染されることが判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
培養細胞において確認されたFructose-bisphosphate aldolase Aは、ウシおよびマウスの腸管上皮においてもその発現が確認された。さらに、経口接種したプリオン蛋白を取り込み、生体内に侵入させると考えられているM細胞に特異的に発現していることを明らかにした。この実験結果は、生体内においてaldolaseAがプリオン蛋白の取り込みに関連していることを強く示唆する内容であり、今後の研究進展を保証するものとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
プリオン持続感染神経細胞株の細胞質タンパクを抗プリオン蛋白抗体による免疫沈降を行い、異常プリオン蛋白とプリオン蛋白親和性蛋白の細胞内での共存性を確認する。次に、M細胞に分化したBIE細胞の上部培養液中にプリオン蛋白親和性蛋白に対する抗体を上部培養液中に加え、トランスサイトーシスに及ぼす影響の解析を行う。次に、トランスサイトーシスを抑制する蛋白を選別し、その蛋白に対するsiRNA蛋白発現干渉抑制のベクターをBIE細胞に感染させて発現抑制細胞株を作出し、M細胞分化能の確認と異状プリオン蛋白のトランスサイトーシスへの影響を解析する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本研究課題を遂行するために必要な設備および機器類は既に整っているので、本研究でも継続して使用可能である。よって、研究は組織細胞化学、細胞生物学と遺伝子解析が中心的な手法となるために、本研究費は組織染色試薬、牛胎児血清、ディスポ器具および培養関連試薬と遺伝子関連試薬などの消耗品購入費が主体で、今年度は特に細胞内aldolase Aをノックアウトする遺伝子試薬に重点的に予算を充てることなるが、予算内での実行が可能である。
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