研究課題
基盤研究(B)
本研究は、家畜の卵胞発育を制御する視床下部神経機構において、神経ペプチドのひとつであるニューロキニンBが黄体形成ホルモン分泌頻度を亢進し、卵胞発育を刺激するメカニズムについてヤギを用いて解明することを目的とする。これにより、家畜の繁殖障害の予防や新規な治療法にニューロキニンB製剤を応用するための基礎データを集積する。今年度は、弓状核の「KNDyニューロン」特異的にチャネルロドプシン2(ChR2)またはハロロドプシン(HR)を発現する遺伝子改変ヤギの作出に向けた基盤的知見を集積するため、ヤギニューロキニンB遺伝子(TAC3)プロモーター領域を同定することを目的として、ヤギTAC3のゲノム構造を明らかにした。雌シバヤギ血液から採取したゲノムDNAサンプルを用いて、ゲノムウォーキング法によりヤギTAC3上流域を解析し、推定翻訳開始点の約2.7kb上流までの塩基配列を取得した。この領域には、エストロジェン受容体、Sp1など繁殖機能に関与する転写因子の結合部位が存在していた。また、マウス視床下部由来不死化細胞株またはヒト神経芽細胞腫由来細胞株を用いたルシフェラーゼアッセイにより、ヤギTAC3の-197～+166領域が強いプロモーター活性を有することを確認した。今後、ヤギmo3遺伝子転写調節因子の探索を行うとともに、ヤギTAC3のゲノム構造およびプロモーター領域の情報を「KNDyニューロン」特異的な遺伝子改変ヤギの作出に活用する。さらに、光感受性イオンチャネルを発現する「KNDyニューロン」の遺伝子改変ヤギが作出された後の実験系確立のため、視床下部神経活動を記録しながら任意のタイミングでレーザー光照射を行う手法の開発に着手した。
2: おおむね順調に進展している
研究計画では、平成24年度にはヤギTAC3のゲノム構造を明らかにし、TAC3プロモーター領域とその転写調節因子の探索を行うことを予定していた。TAC3転写調節因子の同定には至っていないが、強いプロモーター活性を有する領域の同定は完了し、当初の目的はおおむね達成できた。現在、本研究の成果を関連学術誌に投稿中である。また、視床下部神経活動記録法の確立はやや遅れているが、次年度には完了する予定である。
本研究では、ヤギTAC3プロモーター領域下流にChR2またはHR遺伝子を安定的に発現する細胞系を樹立した後に、体細胞クローン技術を利用して弓状核の「KNDyニューロン」特異的にChR2およびHRを発現する遺伝子改変ヤギを作出することを当初の目的としていた。相同組換えによる遺伝子導入にはTALEN法を用いることを予定しているが、遺伝子改変ヤギの作出には相当の時間を要することが想定されるため、今後は、ヤギTAC3プロモーター領域の下流にChR2またはHR遺伝子を組み込んだアデノ随伴ウィルスベクターを視床下部弓状核に直接投与することにより、「KM)yニューロン」にChR2およびHRを発現させたヤギを作出し、「KNDyニューロン」機能を解析することを並行して実施する。
平成24年度は、ヤギTAC3プロモーター領域の同定が予定以上に順調に進んだこと、また、視床下部神経活動記録法の検討がやや遅れたことから、試薬類の購入費や電気工作材料費が予想以上に少なかったため、次年度使用額として約73万円を計上することとなった。平成25年度に請求予定の240万円は、TAC3遺伝子転写調節メカニズムの解析のための試薬類、プラスチック消耗品類などの遺伝子実験用資材、および、視床下部神経活動の記録法確立のための資材調達のために次年度使用額を合わせて使用し、本研究計画を円滑に推進するために活用する。
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すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (13件)
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