イヌＥＳ細胞・ｉＰＳ細胞の血液系再生医療に向けた応用的基盤技術の開発

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24380172
• 研究機関: 大阪府立大学
• 研究代表者: 稲葉 俊夫 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (00137241)
• 研究分担者: 今井 裕 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (10303869) ; 杉浦 喜久弥 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (30171143) ; 鳩谷 晋吾 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (40453138) ; 玉田 尋通 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (10155252) ; 川手 憲俊 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (80221901) ; 高橋 正弘 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 助教 (50582334) ; 谷 浩行 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (00305658)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 再生医療 / 統合動物科学 / ES細胞 / iPS細胞 / バイオテクノロジー / イヌ

研究概要

本研究は、ヒトと共通の疾病が自然発症するイヌに着眼し、ヒト再生医療の実用化を円滑に進め得るトランスレーショナルリサーチの一つとして、イヌ胚性幹細胞（ES細胞）および人工多能性幹細胞（iPS細胞）の血液系再生医療に向けた応用的基盤技術の開発を目的としている。本研究年度では、成犬皮膚線維芽細胞からのiPS細胞株の樹立について検討した。また細胞の継代法についてネコiPS細胞のそれと比較検討した。さらに、分化誘導実験の一環として、昨年度に作製したイヌ胎子線維芽細胞由来iPS細胞から神経細胞への分化誘導方法についても検討し、以下の結果を得た。
１．成犬皮膚線維芽細胞にレンチウイルスを用いてヒト由来の4つの多能性関連転写遺伝子（OCT3/4、 SOX2、KLF4およびC-MYC）を導入し、iPS様細胞コロニーを得た。本コロニーはマウスiPS細胞と同様のドーム型を示し、塩基性線維芽細胞増殖因子およびウシ胎子血清（FBS）を加えたES細胞培地で24継代まで維持できたが、一方、白血病阻害因子(LIF)およびFBS添加培地では2継代までで死滅した。
２．ネコ胎子線維芽細胞にレトロウイルスを用いてマウス由来の上記４つの転写因子を導入し、iPS様細胞コロニーを得た。本コロニーはヒトiPS細胞と同様の扁平型を示し、LIFおよびFBS添加培地で45継代まで維持できた。樹立した細胞株は、未分化マーカー(ALP、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog)の発現があり、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の各マーカーの免疫染色に陽性を示す細胞へ分化することも確認された。
３．イヌiPS細胞を神経誘導培地で培養することで神経幹細胞マーカーであるNestinに陽性を示す細胞を得た。本細胞は各神経系細胞誘導培地で培養することにより、幼若神経細胞、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトの各マーカーの免疫染色に陽性を示す細胞へ分化可能な神経幹細胞の特性を有していた。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

今年度に予定していた①細胞の凍結保存法、②新規のリプログラミング誘導系を用いるiPS細胞の作製、および③臨床応用の検討には至らず、来年度から行うこととなったため。

今後の研究の推進方策

今年度に引き続いて、①細胞の長期継代培養法および凍結保存法の確立、②piggyBacおよびドキシサイクリンを用いたリプログラミング誘導系によるiPS細胞の安定的樹立と細胞分化制御、③イヌ固有の幹細胞成長因子、顆粒球コロニー刺激因子などの特異的サイトカインを用いて、イヌES細胞・iPS細胞から血小板および顆粒球等の血液系細胞へ効率的に分化誘導する技術の開発、および④iPS細胞の臨床応用を目指す。

研究成果

• [雑誌論文] Evaluation of serum phosphorylated neurofilament dubunit NF-H as a prognostic biomarker in dogs with thoracolumbar intervertebral disc herniation (2014)
  • 著者名/発表者名: Nishida H, Nakayama M, Tanaka H, Kamishina H, Izawa T, Hatoya S, Sugiura K, Suzuki Y, Ide C, Inaba T.
  • 雑誌名: Veterinary Surgery 巻: 43 ページ: 289-293
  • DOI: 10.1111/j.1532-950X.2014.12144.x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Valproic acid treatment from the 4-cell stage improves Oct4 expression and nuclear distribution of histone H3K27me3 in mouse cloned blastocysts. (2013)
  • 著者名/発表者名: Isaji Y., Murata M., Takaguchi N., Mukai T., Tajima Y., Imai H., Yamada M.
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: ２２ ページ: 196-204
  • DOI: 10.1262/jrd.2012-156
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of functional platelets from canine induced pluripotent stem cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishimura, T., Hatoya, S., Kanegi, R., Sugiura, K., Wijewardana, V., Kuwamura, M., Tanaka, M., Yamate, J., Izawa, T., Takahashi, M., Kawate, N., Tamada, H., Imai, H., Inaba, T.
  • 雑誌名: Stem Cells and Development 巻: 22 ページ: 2026-2035
  • DOI: 10.1089/scd.2012.0701
  • 査読あり
• [雑誌論文] The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishida M, Okazaki E,Tsukamoto S, Kimura K, Aizawa A, Kito S, Imai H, Minami N.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e68686
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0068686
  • 査読あり
• [雑誌論文] ING3 is essential for asymmetric cell division during mouse oocyte maturation (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki S, Nozawa Y, Tsukamoto S, Kaneko T, Imai H, Minami N.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e74749
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0074749
  • 査読あり
• [雑誌論文] Production of canine soluble CD40 ligand to induce maturation of monocyte derived dendritic cells for cancer immunotherapy (2013)
  • 著者名/発表者名: Wijewardana, V., Sugiura, K., Yahata, M., Akazawa, T., Wijesekera, D.P., Imamoto, S., Hatoya, S., Inoue, N., Inaba, T.
  • 雑誌名: Veterinary Immunology and Immunopathology 巻: 156 ページ: 121-127
  • DOI: 10.1016/j.vetimm.2013.09.016
  • 査読あり
• [雑誌論文] Improvement of superovulatory response and pregnancy rate after transfer of embryos recovered from Japanese black cows fed rumen bypass polyunsaturated fatty acids. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takahashi, M., Sawada, K., Kawate, N., Inaba, T., Tamada, H.
  • 雑誌名: Journal of Veterinary Medical Science 巻: 75 ページ: 1485-1490
  • DOI: 10.1262/jrd.2013-025
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clinical study report on milk production in the offspring of a somatic cell cloned Holstein Cow (2013)
  • 著者名/発表者名: Takahashi, M., Tsuchiya, H., Hamano, S., Inaba, T., Kawate, N., Tamada, H.
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: 59 ページ: 595-598
  • DOI: 10.1262/jrd.2013-025
  • 査読あり
• [学会発表] Improvement of dendritic cell-based immunotherapy for enhancing systemic immune responses against cancer (2013)
  • 著者名/発表者名: Wijewardana, V., Sugiura, K., Akazawa, T., Wijesekera, D.-P. H., Imamoto, S., Inoue, N., Inaba, T.
  • 学会等名: 第42回日本免疫学会学術集会
  • 発表場所: 千葉
  • 年月日: 20131211-20131213
• [学会発表] イヌiPS細胞から神経系細胞への分化誘導 (2013)
  • 著者名/発表者名: 因野由衣子、西村俊哉、西田英高、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、川手憲俊、高橋正弘、玉田尋通、稲葉俊夫
  • 学会等名: 第156回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 岐阜
  • 年月日: 20130920-20130922
• [学会発表] 全身的抗腫瘍免疫反応を増強した樹状細胞療法の改善 (2013)
  • 著者名/発表者名: 東彩夏、杉浦喜久弥、立花夕季、赤澤隆、今本茂樹、Wijesekera D.-P. H.、Wijewardana, V、鳩谷晋吾、井上徳光、稲葉俊夫
  • 学会等名: 第156回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 岐阜
  • 年月日: 20130920-20130922
• [学会発表] ネコの体外受精法の改善に向けた酸素濃度および顕微授精についての検討 (2013)
  • 著者名/発表者名: 藤木花奈、鳩谷晋吾、杉浦喜久弥、高橋正弘、川手憲俊、玉田尋通、稲葉俊夫
  • 学会等名: 第156回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 岐阜
  • 年月日: 20130920-20130922
• [学会発表] ウシ血中脂肪酸組成ならびに経腟採卵による卵子の体外発生能に及ぼすバイパス不飽和脂肪酸給与の影響 (2013)
  • 著者名/発表者名: 伊藤太一、山本公平、岸昌生、上田省吾、鳩谷晋吾、稲葉俊夫、川手憲俊、玉田尋通、高橋正弘
  • 学会等名: 第156回日本獣医学会学術集会
  • 発表場所: 岐阜
  • 年月日: 20130920-20130922
• [学会発表] イエネコ体細胞を用いた人工多能性幹細胞の誘導 (2013)
  • 著者名/発表者名: 古田侑吾・川口高正・南 直治郎・山田雅保・稲葉俊夫・今井 裕
  • 学会等名: 第63回関西畜産学会
  • 発表場所: 滋賀
  • 年月日: 20130905-20130906
• [学会発表] 急性骨髄単球性白血病の犬の一例 (2013)
  • 著者名/発表者名: 鍋谷知代、鳩谷晋吾、水元裕、杉浦喜久弥、稲葉俊夫
  • 学会等名: 平成25年度獣医学術近畿地区学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20130901-20130901
• [学会発表] Generation of functional platelets from canine induced pluripotent stem cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishimura, T., Hatoya, S., Kanegi, R., Sugiura, K., Wijewardana, V., Kuwamura, M., Tanaka, M., Takahashi, M., Kawate, N., Tamada, H., Imai, H., Inaba, T.
  • 学会等名: The International Society for Stem Cell Research (ISSCR) 11th Annual Meeting
  • 発表場所: 米国ボストン
  • 年月日: 20130613-20130615
• [学会発表] Generation of induced pluripotent stem cells and production of leukemia inhibitory factor (LIF) in domestic cats (2013)
  • 著者名/発表者名: Kanegi, R., Hatoya, S., Takenaka, S., Nishimura, T., Wijewardana, V., Sugiura, K., Takahashi, M., Kawate, N., Tamada, H., Inaba, T.
  • 学会等名: The International Society for Stem Cell Research (ISSCR) 11th Annual Meeting
  • 発表場所: 米国ボストン
  • 年月日: 20130613-20130615
• [備考] Laboratory of Cell Pathobiology
  • URL: http://www.vet.osakafu-u.ac.jp/cellE/cellE.html