研究課題
ゲノム安定性の維持は、生命にとって極めて重要であり、その進行はクロマチンや細胞核構造を基盤としたエピジェネティック制御を受ける。しかし、その分子機構の理解は遅れている。我々は、アクチンファミリーメンバーであるアクチン関連タンパク質(Arp)が、ATP結合を介した「分子スイッチ」として、DNA修復におけるエピジェネティック制御に関わることを見出しその解析を行った。出芽酵母でDSBを誘導した際の、NPCやMps3へのDSBの核内移動のタイミングをChIPや定量蛍光顕微鏡解析によって解析したところ、DSBのこれらの核膜タンパク質への移行は異なったメカニズムによって制御されており、またDSB修復において異なる機能を有することが示された。これらのDSBの核膜への以降には、SWR1クロマチンリモデリング複合体およびINO80クロマチンリモデリング複合体が関与していることも示された。また、核内Arpに結合するbicycle peptideのスクリーニングを行い、Arp5およびArp8に結合するbicycle peptideの候補を得た。Arp8の遺伝子を破壊した培養細胞において、放射線あるいはDNA損傷試薬により形成されたDSBの核内空間配置の変化をgammma H2AX染色で比較したところ、DNA損傷修復に欠陥があることが示された。また、このArp8遺伝子破壊細胞を用いて分裂期染色体核型解析を行ったところ、染色体切断や転座の効率をが上昇していることが示された。
1: 当初の計画以上に進展している
出芽酵母を用いて、DNA二重鎖領域が核膜タンパク質に移行するメカニズムの一端を明らかにすることができた。この結果は、クロマチン構造変化と細胞核レベルでのDNA損傷修復のプロセスが協調して機能していることを示す新たな知見である。また、Arp8遺伝子破壊株におけるDNA損傷修復が観察され、この細胞がクロマチン・細胞核とDNA損傷修復プロセスを解析する上での優れたモデル系となることが示された。さらに、Arp8およびArp5に結合するbicycle peptideが得られたことで、このような機構を分子レベルで解析し、さらに創薬に応用展開するための基盤が得られた。
これまでにも用いていた出芽酵母にDNA二重鎖切断を導入する方法をさらに利用して、DNA損傷部位の核膜への移動のダイナミクスや、NPCおよびMps3の関与を、さらに分子レベルで明らかにする。また、ArpのATP結合部位に変異を導入し、これをArpの欠損細胞で発現させることにより、Arpの分子スイッチとしての機能をさらに解明する。また、これまでの研究で得られたbicycle peptideを用いて、in vitroおよびin vivoでのArpのDNA損傷修復への関与を明らかにしていく。さらに、がん細胞などを用いることで、これらのbicycle peptideを創薬に応用展開することを目指す。
DNA二重鎖切断部位の核膜への移行に、SWR1クロマチンリモデリング複合体が関与していると考えて解析を進め、この複合体の詳細な解析を行うために消耗品を使用することを計画していたが、研究の過程でINO80クロマチンリモデリング複合体も、DNA二重鎖切断部位の核内での挙動に関与するという、新たな発見が得られた。そのため、SWR1複合体の解析に先立って、INO80複合体の関与を確認するためのコンストラクト・酵母株を作成する必要が生じた。SWR1クロマチンリモデリング複合体の詳細な解析を行うための消耗品費として使用する他、あらたに明らかになったINO80クロマチンリモデリング複合体の関与を詳細に解析するための消耗品費としても、この研究費を用いる。
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Oncogene
巻: 33 ページ: 1640-1648
10.1038/onc.2013.125
BBB
巻: １２３ ページ: 123－124
International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics
巻: in press ページ: in press
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013 69, 2431-2439.
巻: 69 ページ: 2431-2439
10.1107/S090744491302252X
