| 研究課題/領域番号 |
24390015
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
山本 一夫 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 教授 (20174782)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | レクチン / 糖鎖 / 蛋白質 |
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| 研究概要 |
ピストンや転写因子等の核内タンパク質に付加されるβ-N-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)修飾は、糖鎖伸長が起こらず且つ可逆的な反応である点で、小胞体やゴルジ体で起こる糖鎖修飾とは性質を異にする。このO-GlcNAc修飾の細胞生物学的意義を明らかにするために、手始めにcellsurfacedisplay法を用いて、マメ科レクチンの2つの糖認識ループのアミノ酸をランダムに置換したライブラリーの中からO-GlcNAc特異的な改変レクチンの取得を試みた。
CD3ζの細胞質ドメイン、及びCD8の膜貫通ドメインを融合させた改変レクチンcDNAライブラリーを、GFPレポーター細胞2B4の細胞表面に発現させた。C及びDループにランダムなアミノ酸を導入した10種類、計5.0x10 6のライブラリーを作成しスクリーニングに供した。β-GlcNAc糖鎖ポリマーをコートした肌ISAプレート上で、改変レクチン発現2B4細胞を培養し、GFPの発現誘導を指標に、β-GlcNAc結合性レクチン発現細胞をセルソーターによって回収・濃縮を行った。さらに陽性細胞をクローニングし、改変レクチン遺伝子を特定した。取得した改変レクチンは、程度の差はあれGlcNAcのみでなくGalおよびその誘導体とも結合し、2B4細胞表面上に発現している糖鎖を認識してGFP陽性となっている可能性が考えられた。
そこで次に、EMSを用いたレクチン耐性2B4細胞の作成、benzyl-GalNAc処理2B4細胞の利用、糖存在下でのスクリーニング等を検討したが、最終的にGFP陽性の1つの細胞をマニュピレーターで回収し、この細胞からRNeasy micro kit、OneStep RT-PCRkitを用いて改変レクチン遺伝子を特定する技術を確立し、上記の問題を解決することが可能となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
改変レクチンの作成に関して当初予想していなかった問題点が見つかったが、これに関する解決策を検討した過程で、より優れた方法を確立することができた。従来法では2,3か月かかっていたスクリーニングがわずか1週間程度に短縮することができ、スクリーニング効率を上げることができたことから、結果として順調に進展していると判断できる。計画のライブイメージングに関してはできていないが、遺伝子の作成も進展しており問題ない。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画通り、0-GlcNAc修飾の細胞内における反応をライブイメージングで追跡すること、0-GlcNAc修飾タンパク質の同定、また、分化・増殖に伴ってこれらの修飾がどのように変化するかについて検討する。
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