| 研究課題/領域番号 |
24390055
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
本間 さと 北海道大学, 大学院・医学研究科, 特任教授 (20142713)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 生体リズム / 時計遺伝子 / 視交叉上核 / ネットワーク / イメージング |
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| 研究概要 |
哺乳類分子時計は時計遺伝子の転写翻訳フィードバックループによると考えられてきたが、我々は、CRFY欠損マウスの個々の視交叉上核(SCN)細胞がリズム発振すること、CRYはSCNの時計システムの発達に与していることを明らかにし、従来の分子時計機構を根底から覆した。本研究は、生物時計が成長に伴い質的に異なる時計システムを形成するに至る分子・細胞基盤を明らかにすることを目的とする。本年は、以下の2実験を行った。
1.新生児型および成獣型ネットワークに関わる細胞・分子基盤:SCN内ネットワーク形成と維持に関わる物質をSCN神経が分泌するとの仮説に基づき、細胞リズムが脱同調している成獣CRY1/CRY2欠損マウスのPER2::LUCリズムを指標に、生後1～21日の各段階の野生型SCNを共培養し、リズム回復の有無を検討した。その結果、新生児期のSCNはリズムを回復させ、生後21日のSCNでは回復は無かった。このため、新生児期に分泌される液性因子がCRY欠損マウスの細胞リズムを同期させること、CRY欠損成獣マウスのSCNには受容体など液性因子に反応する機能が保存されていることが分かった。しかし、SCNの主要ペプチドであるAVP,VIP,GRPの滴下でリズムは回復しないため、これらの一過性上昇だけではリズム同期作用がないことも分かった。
2.発達期の光環境とCRY機能:CRY1/CRY2欠損マウスを出生直後から恒常明で飼育すると、成獣となってからの恒常暗暴露により概日周期の行動リズムが出現することを明らかにした。背後のメカニズムの探索のため、SCNの時計遺伝子リズムを測定したが、リズム発現は一部のマウスに限られ、行動リズムとの乖離が確認された。発達期の恒常明は、SCN細胞の一部の同期に関わることも明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
実験1については、液性因子によるリズム同期を明らかにすると共に液性物質によるリズム発現の臨界期を明らかにし、成果をNature Comm.発表した。また、液性以外にもテトロドトキシンによるシナプス連作の抑制でも同様のphenotypeを生じることから、神経性の同期機構も存在することを明らかにした。一方、ペプチド投与実験は行ったが、これらの投与だけではリズム同期は生じないことも明らかにした。当初は、CRY欠損マウスと同様に無周期変異とされたBmal1欠損マウスでも検討する予定であったが、繁殖が困難な上、ホモは幼少時に死亡し成体が得られないためこの実験を断念せざるを得なかった。総合的には、予定した実験をこなし、予測以上の成果を得ることができたと判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
24年度は、Bmal1欠損マウスでも検討を行うべく、交配飼育に全力を上げた。しかし、ホモ個体は出生数が極端に少ない上、脂肪の発達が悪いというこれまでの報告と同様、離乳後に痩せてきて実験使用前に死亡してしまい、発光レポーターマウスとの交配が全く進まなかった。このため、予定が遅れ、研究費を次年度に繰りこした。Bmal1欠損マウスの実験は勝算がないと判断し断念することとした。次年度は、Cry欠損マウスに集中し、CRY依存性と非依存性のSCN内細胞振動ネットワーク形成を形成する因子を分子レベルで解明する。液性因子については、SCNの主要ペプチドAVP,VIP,GRPの他、SCNから分泌されるBDNFその他の因子の関与を検討する。また、神経性連絡についても、テトロドトキシンの幼若期の振幅抑制と成獣の抵抗性を手がかりに検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
CRY依存性と非依存性のSCN内細胞振動ネットワーク形成を形成する因子のうち、液性因子については、SCNの主要ペプチドAVP,VIP,GRPの他、SCNから分泌されるBDNFその他の因子の関与を検討する。また、神経性連絡については、テトロドトキシンの幼若期の振幅抑制と成獣の抵抗性を手がかりに検討する。このため、ネットワーク形成におけるVIPおよびVIP受容体の役割について、競培養やトリプルノックアウトの発光レポーターを用い検討する。
VIP発現のレポーターマウスがいないため、必要に応じてin situ hybridizationなどでmRNAリズムの生後発達も検討する。また、VIP受容体のセカンドメッセンジャーである(AMPの役割、カルシウムイオンの役割についても検討することで、同期に関わる因子を追求する。
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