| 研究課題/領域番号 |
24390055
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
本間 さと 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任教授 (20142713)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 生体リズム / 時計遺伝子 / 視交叉上核 / ネットワーク / イメージング |
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| 研究概要 |
本研究は、概日振動分子機構とされてきた時計遺伝子転写翻訳フィードバックが破綻したために無周期となるとされたCRY欠損マウスにおいて、細胞振動は生涯持続するが、発達に伴う振動細胞ネットワーク形成が障害され、成獣でのリズム出力が欠損する、という我々の発見に基づき、発達に伴う時計遺伝子CRY依存性細胞振動ネットワーク形成に関わる分子・細胞基盤の解明を目的とする。
平成25年度は、神経性伝達と液性伝達の可能性の両面から研究を進め、TTX投与が新生児CRY欠損SCNのリズムを脱同期させることを明らかにした。一方、液性同期については、VIPおよびAVPが細胞間シグナルである可能性を検討するため、PER2::LUCレポーターを有するVPAC2受容体・CRY1/2のトリプルノックアウト作成、CRY欠損AVP-Elucマウスの作成を進めた。VIPに関しては、関与を示唆する結果を得たため、実験例を追加し検討中である。AVP-Elucは、概日リズムのレポーターとして利用できることを、発光、行動、光パルス実験等で明らかにし、H26年度実験に向け、ダブル、トリプルノックアウト、トリプルトランスジェニックなどの作成を進めている。
一方、CRY欠損SCNの組織レベルのPER2リズムは、離乳時には消失しているため、新生児期のリズムが生理的なリズム出力に繋がるかどうか不明である。そこで、新生児期の環境照明の果たす役割に注目し、出生直後から離乳後3週間まで恒常明下で飼育した。その結果、恒常明下で発育した大多数のCRY欠損マウスが、恒常暗で行動リズムを示すこと、その周期分散は大きく、しばしば相対的協調を示すことが分かった。野生型の成獣を恒常明に暴露すると行動リズムは長短2成分にスプリットすることから、CRYにおいても、行動を支配する2振動体が存在し、振動体内の同期が新生児期からの恒常明で回復することが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
発達に伴う時計遺伝子CRY依存性細胞振動ネットワーク形成に関わる分子・細胞基盤のうち、細胞間リズム同期シグナルに、Naチャネルを介する神経活動メカニズムが関与すること、液性シグナルとして、特にVIPの関与を示唆する結果を得た。VIPがSCN腹側領域の主要ペプチドであり、SCN細胞のほぼすべてが受容体をもつことから、神経発火に伴うVIP分泌が新生児期においてはCRY非依存性に同調因子として作用することが示唆され、研究は大きく前進した。また、AVPの関与を検討するためのAVPレポーターマウスを作成し、概日リズムレポーターとして使用できることを明らかにした。本マウスはH26年度の研究に大きな進展をもたらすだけでなく、SCNからの生理的出力のレポーターとして今後リズム研究全般に利用価値が高く、神経内分泌研究への応用にも期待がかかる。
また，H25年度においては、CRY欠損マウスが、出生後から恒常明で飼育することにより、行動に概日リズムを示すことができたのは非常に大きな発見である（PLoS One, 2013）。本マウスが無周期ではないこと、振動停止モデルではないこと、時計遺伝子転写翻訳ループ仮説がもはや、決定的ではないことなどを明らかに示すことが出来、哺乳類概日振動分子メカニズム研究に発想の転換を強いる結果となった。
原著論文の発表についても、平成25年度にNat.Comをはじめ9編の査読付き英文原著論文を発表し、さらに平成26年4月にacceptされた原著論文、印刷中の英文著書3編を控えている。さらに、現在、査読中の論文1編、投稿の最終段回にある論文が４編あり、予想を超える成果が上がったと言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
H25年度に、AVPおよびVIPが､新生児期のCRY非依存性ネットワーク、発達に伴うCRY依存性ネットワークのシグナルである可能性を検討するため、トリプルノックアウトマウス、4重ノックアウトマウスとPER2::LUCやAVP-Elucなどのレポーターマウスとの交配を進め、これらの関与を検討する条件が整った。そこで、年齢、genotypeを組み合わせた組織発光リズム計測、発光イメージングによる部位特異性、細胞特異性の検討、共培養による液性因子の同定を進める。その際、受容体ノックアウトとペプチドノックアウトへの野生型や単独欠損マウスの共培養、受容体拮抗剤の投与などを組み合わせ、次年度研究により同調シグナルを同定する。さらに、細胞内情報伝達についても、特にCaイオンの関与を検討するため、Caキレート剤の影響、CRY欠損の影響についても検討を加える。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
発光イメージングにて、視交叉上核培養組織より遺伝子発現を計測してきたが、研究の進展に伴い、リズム出力を同一培養組織で検討する必要性が生じた。このため、比較的大きな培養組織から、長期発光イメージングが可能な光学系の改良を検討した。測定機器開発に積極的であった一社より、試作機で検討を加えたが、年度内に目的に合致する改良が完成しなかった。平成26年度始めには、本研究に使用可能な機器が完成する予定がたったため、平成26年度予算で購入し、研究を進める予定である。
MutiVersaインキュベーターシステム（アトー社）4,974,210を5月末に購入予定である。
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