| 研究課題/領域番号 |
24390060
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
小笹 徹 東京大学, 先端科学技術研究センター, 特任教授 (70202059)
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| 研究分担者 |
鈴木 信周 東京大学, 先端科学技術研究センター, 特任助教 (90247007)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | シグナル伝達 / G蛋白質 / Rho |
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| 研究概要 |
G12/13を介する伝達系は、細胞の増殖や癌化において重要な役割と果たしていることが報告されているが、その分子機構には未だ不明の点が多い。本計画では、 G12/13-RhoGEFシグナル制御の複合体の構造解析、生化学的解析、及び癌細胞でのプロテオミクス解析を行いG12/13-RhoGEFシグナル伝達系の分子機構を詳細に理解することを目指す。以下の3課題を計画した。
1. Gα12/13-RhoGEFの複合体の構造と機能の解析
2. RGS-RhoGEFのリン酸化修飾と機能の解析
3. 癌細胞でのG12/13-RhoGEFシグナル複合体のプロテオミクス解析
平成24年度は、主に課題1と課題2の実験を行った。課題1については、Gα13、p115RhoGEF、及びRhoAの大量調製を行い、ゲル濾過カラムにて３者複合体の調製を行い、様々な結晶化条件の検討を行ったが、結晶にはまだ至っていない。 現在、引き続き結晶化の最適条件の検討を行っている。また、p115RhoGEFの代わりにやはりGα12/13の下流で機能しているLARGを用いた複合体も作製している。また、Ga12とp115のRhoGEFの複合体についても実験を進めている。課題２については、白血病細胞HL60においてp115RhoGEFのリン酸化部位を質量分析により決定し、それらの部位の変異体を作製して、その機能に重要と考えられるリン酸化部位を同定した。現在更に詳しくこの部位のリン酸化修飾がRhoGEFの機能に及ぼす影響を検討していて、その結果を論文にまとめる計画である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Gα12/13、p115RhoGEF、RhoAの3者複合体の調製において、p115RhoGEFが不安定で調整中に分解されやすく、結晶化にむけた複合体の大量調製に時間を要している。より安定な複合体を調製するためにRhoGEFの欠失変異体を作製したり、p115RhoGEFの代わりにLARGを用いて、結晶化を検討しているため当初の計画より時間を要している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、より安定したG12/13-RhoGEF複合体の大量調製を行い、結晶化を目指す。また、RGS-RhoGEFでp115RhoGEF以外のLARG及びPDZ-RhoGEFに対する特異的抗体も調製できたのでこれらを用いて癌細胞より免疫沈降し、リン酸化の状態を質量分析機で決定し、その機能に及ぼす影響を分析する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
G12/13-RhoGEFシグナル複合体の結晶化に時間を要したため、当初予定より遅れが生じたため。
G12/13-RhoGEFシグナル複合体の結晶化の条件の検討を更に進める計画である。
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