乳癌進展における微小環境シグナリングのリン酸化プロテオミクス解析と組織での可視化

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24390087
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 吉田 利通 三重大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80166959)
• 研究分担者: 紅林 淳一 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (10248255) ; 田中 典子 (花村 典子) 三重大学, 医学部附属病院, 講師 (60437100) ; 小塚 祐司 三重大学, 医学部附属病院, 講師 (50378311) ; 下條 尚志 三重大学, 医学部, 技術員 (70410751)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 乳癌 / 癌進展 / 微小環境 / プロテオミクス / リン酸化 / 癌幹細胞

研究概要

本年度では、テネイシン-C（TNC）とTGF-β添加後の細胞におけるリン酸化状態を、逆相タンパク質アレイ (RPPA)を用いて網羅的に検討を行った。Western blot法により、SRCとFAKのTyrリン酸化は処理により増強することを再確認したサンプルを用いたが、RPPA法ではリン酸化の増強が確認できなかった。Ser/Thrのリン酸化については、TGF-β添加でのリン酸化シグネチャとTNCやTNC+TGF-βのシグネチャは明らかに異なっており、後者ではPDK1、P70S6K、RSK2、cRAF、ELF4Gなどでリン酸化の増強がみられ、ERK1/2やRSK1は低下傾向にあった。その他にTyrリン酸化で、cMetのリン酸化の軽度亢進をみとめたのみであった。Tyrリン酸化は、Ser/Thrリン酸化に比較し、量的に少なくRPPA法では検出が困難であることが示唆された。
これらについて、Western blotで結果を検証したところ、cRAFとElf4Gのリン酸化の亢進は確認できた。また、ERAK1/2では逆の結果でリン酸化の亢進がみられた。これらのリン酸化タンパク質については、組織標本での検出を試みているところで、ERK1/2については培養細胞と癌細胞と間質細胞での発現が染色で観察できた。また、別の検討で、マクロファージについては、TNC処理により、NFkBのリン酸化と核移行が観察されることから、癌間質のマクロファージ（TAM）へポジティブな作用が考えられる。乳癌幹細胞については、フローサイトメトリで幹細胞リッチな分画を培養細胞の種類によっては十分量確保できることがわかったので、RPPA法とWestern blotでの解析を今後行う予定である。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本年度から、TNC添加による擬似的な癌進展が進んだ細胞の網羅的リン酸化解析のため、RPPA法を行うことにした。このためにはかなり多量のTNCを必要とする。その精製を行っていたが、産生細胞が不調となり産生が少なく量がとれなくなった。そのため、産生細胞を新たに購入し、再度産生系を立て直す必要が生じた。また、精製機械が老朽化しており、故障が頻回に生じたため、装置の一部の入れ替えを行い、精製系も再構築を行った。この研究の根幹部分の不具合のため、実験の進行が遅れた。現在はいずれも回復し、来年度の実験に必要量のTNCは確保できている。

今後の研究の推進方策

1）ヒト乳癌組織内のTyrリン酸化のプロテオミクス解析、2）微小環境を再構成した培養細胞を用いたSer/Thrリン酸化と細胞機能との関連、3）ヒト乳癌組織内でのTyrおよびSer/Thrリン酸化シグナルの免疫組織化学による解析、4）癌幹細胞におけるリン酸化シグネチャの解析について以下の方法・方向性をもって研究を行う。
1）については採取されている試料をひとまず用いて、FAK/SrcなどのTyrリン酸化に絞って解析を行い、その結果を目標に網羅的な解析を試みる。さらに、前年度に行ったReverse Phase Protein Array (逆相タンパク質アレイ、RPPA) で差異がでたTyrリン酸化タンパク質についてもWestern blot法を用いて検討する。
2）については、培養細胞試料を用いて行ったRPPA法の結果でみられたTGF-betaやTNC処理後での変化をそれぞれのタンパク質について通常のWesternBlotでの解析をおこなう。また、間質を構成する細胞、特にマクロファージ、線維芽細胞についても検討を行う。これらのリン酸化タンパクの局在についても蛍光抗体法で観察を行う。
3)では、脱リン酸化を阻害した試料を用い、いくつかのリン酸化部位の検出に安定的に成功しているので、FAKとSRCのリン酸化について再び行っていく。ただし、これらのリン酸化の検出はリン酸化量が少ないと考えられ、RPPA法によって判明した下流と考えられる量的に多いSer/Thrリン酸化タンパクの免疫染色も試みる。
4）については、TNCが幹細胞プールを増加させ得るかを引き続き検討する。また、十分な細胞が確保する目途がついたので、RPPA法を用いて通常細胞と幹細胞の比較により、幹細胞に特異的なリン酸化シグネチャを明らかとする。

次年度の研究費の使用計画

前述したように、TNCの精製系の不具合により、研究に遅れが生じたため、次年度での解析に必要な経費を繰り越すことになった。
本研究において、現在の網羅的解析の主力となっているRPPA法による解析に用いる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Tenascin C protects aorta from acute dissection in mice. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kimura T, Shiraishi K, Furusho A, Ito S, Hirakata S, Nishida N, Yoshimura K, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Ikeda Y, Miyamoto T, Ueno T, Hamano K, Hiroe M, Aonuma K, Matsuzaki M, Imaizumi T, Aoki H.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 4 ページ: 4051
  • DOI: 10.1038/srep0405
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Tenascin-C causes neuronal apoptosis after subarachnoid hemorrhage in rats. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tenascin-C causes neuronal apoptosis after subarachnoid hemorrhage in rats. Shiba M, Fujimoto M, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Taki W, Suzuki H.
  • 雑誌名: Transl Stroke Res. 巻: 5 ページ: 238-247
  • DOI: 10.1007/s12975-014-0333-2
  • 査読あり
• [雑誌論文] Antitumor and anticancer stem cell activity of a poly ADP-ribose polymerase inhibitor olaparib in breast cancer cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shimo T, Kurebayashi J, Kanomata N, Yamashita T, Kozuka Y, Moriya T, Sonoo H
  • 雑誌名: Breast Cancer 巻: 21 ページ: 75-85
  • DOI: 10.1007/s12282-012-0356-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Long-term outcome of hypofractionated radiotherapy to the whole breast of Japanese women after breast-conserving surgery. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ishihara T, Yoden E, Konishi K, Nagase N, Yoshida K, Kurebayashi J, Sonoo H, Murashima N, Sasaki R, Hiratsuka J
  • 雑誌名: Breast Cancer 巻: 21 ページ: 40-46
  • DOI: 10.1007/s12282-012-0345-2
  • 査読あり
• [雑誌論文] Prognostic value of phosphorylated HER2 in HER2-positive breast cancer patients treated with adjuvant trastuzumab. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kurebayashi J, Kanomata N, Yamashita T, Shimo T, Mizutoh A, Moriya T, Sonoo H.
  • 雑誌名: Breast Cancer 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: Not assigned
  • 査読あり
• [雑誌論文] Marked lymphovascular invasion, progesterone receptor negativity and high Ki67 labeling index predict a poor outcome in breast cancer patients treated with endocrine therapy alone. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kurebayashi J, Kanomata N, Shimo T, Yamashita T, Aogi K, Nishimura R, Shimizu C, Tsuda H, Moriya T, Sonoo H
  • 雑誌名: Breast Cancer 巻: 21 ページ: 214-222
  • DOI: 10.1007/s12282-012-0380-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Binding of αvβ1 and αvβ6 integrins to tenascin-C induces epithelial-mesenchymal transition-like change of breast cancer cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Katoh D, Nagaharu K, Shimojo N, Hanamura N, Yamashita M, Kozuka Y, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T.
  • 雑誌名: Oncogenesis. 巻: 2 ページ: －
  • DOI: 10.1038/oncsis.2013.27
  • 査読あり
• [雑誌論文] Preliminary study of serum tenascin-C levels as a diagnostic or prognostic biomarker of type B acute aortic dissection. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nozato T, Sato A, Hirose S, Hikita H, Takahashi A, Endo H, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Aonuma K, Hiroe M.
  • 雑誌名: Int J Cardiol. 巻: 168 ページ: 4267-4269
  • DOI: doi: 10.1016/j.ijcard.2013.04.211
  • 査読あり
• [雑誌論文] Tenascin-C induces prolonged constriction of cerebral arteries in rats. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujimoto M, Suzuki H, Shiba M, Shimojo N, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Kanamaru K, Matsushima S, Taki W.
  • 雑誌名: Neurobiol Dis. 巻: 55 ページ: 104-109
  • DOI: 10.1016/j.nbd.2013.01.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] Atrial natriuretic peptide exerts protective action against angiotensin II-induced cardiac remodeling by attenuating inflammation via endothelin-1/endothelin receptor A cascade. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fujita S, Shimojo N, Terasaki F, Otsuka K, Hosotani N, Kohda Y, Tanaka T, Nishioka T, Yoshida T, Hiroe M, Kitaura Y, Ishizaka N, Imanaka-Yoshida K.
  • 雑誌名: Heart Vessels. 巻: 28 ページ: 646-657
  • DOI: 10.1007/s00380-012-0311-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Matricellular protein: a new player in cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage. (2013)
  • 著者名/発表者名: Suzuki H, Shiba M, Fujimoto M, Kawamura K, Nanpei M, Tekeuchi E, Matsushima S, Kanamaru K, Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Taki W.
  • 雑誌名: Acta Neurochir Suppl. 巻: 115 ページ: 213-218
  • DOI: 10.1007/978-3-7091-1192-5_39
  • 査読あり
• [雑誌論文] Aberrantly methylated genes in human papillary thyroid cancer and their association withBRAF/RASmutation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi Y, Tsuji E, Yagi K, Matsusaka K, Tsuji S, Kurebayashi J, Ogawa T, Aburatani H, Kaneda A
  • 雑誌名: Front Genet 巻: 5 ページ: －
  • DOI: 10.3389/fgene.2013.00271
  • 査読あり
• [雑誌論文] 乳がんのサブタイプ分類とゲノミクス． (2013)
  • 著者名/発表者名: 紅林淳一
  • 雑誌名: クリニシアン 巻: 622 ページ: 82-87
• [雑誌論文] ホルモン療法耐性・HER2陰性乳がんに対する薬物治療の実際 1）ホルモン療法 (2013)
  • 著者名/発表者名: 紅林淳一
  • 雑誌名: 臨床腫瘍プラクティス 巻: 9 ページ: 362-366
• [雑誌論文] ホルモン感受性と抵抗性の予測因子 (2013)
  • 著者名/発表者名: 紅林淳一
  • 雑誌名: 癌と化学療法 巻: 40 ページ: 2500-2504
• [雑誌論文] エストロゲン受容体陽性乳癌細胞における抗エストロゲン薬とmTOR阻害薬エベロリムスの細胞増殖及び癌幹細胞制御に対する効果 (2013)
  • 著者名/発表者名: 山下哲正、紅林淳一、鹿股直樹、下登志朗、森谷卓也、園尾博司
  • 雑誌名: 川崎医学会誌 巻: 39 ページ: 65-79
• [雑誌論文] 両側上部領域乳癌に対し真皮脂肪乳腺弁を用いて乳房形成を行った１例 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小川朋子、花村典子、山下雅子、伊藤みのり、木村弘子
  • 雑誌名: 乳癌の臨床 巻: 28 ページ: 435-439
  • 査読あり
• [雑誌論文] Modified round block techniqueとabdominal advancement flapを組み合わせたoncoplastic surgeryを施行した1例 (2013)
  • 著者名/発表者名: 小川朋子、花村典子、山下雅子、伊藤みのり、木村弘子
  • 雑誌名: 乳癌の臨床 巻: 28 ページ: 535-540
  • 査読あり
• [雑誌論文] 7.5cmの単発肝転移を伴ったT1a乳癌の1例 (2013)
  • 著者名/発表者名: 木村弘子、小川朋子、山下雅子、花村典子
  • 雑誌名: 乳癌の臨床 巻: 28 ページ: 337-343
  • 査読あり
• [雑誌論文] ステレオガイド下マンモトーム生検の検討 画像の診断精度と経過観察方針について (2013)
  • 著者名/発表者名: 稲上馨子、花村典子、山下雅子、木村弘子、小川朋子
  • 雑誌名: 日本乳癌検診学会 巻: 22 ページ: 317-322
  • 査読あり
• [雑誌論文] Racquet mammoplastyとabdominal advancement flapを組み合わせたoncoplastic surgery (2013)
  • 著者名/発表者名: 小川朋子、花村典子、山下雅子、伊藤みのり、木村弘子
  • 雑誌名: 乳癌の臨床 巻: 28 ページ: 207-212
  • 査読あり
• [学会発表] テネイシンCからのインテグリンシグナリング (2013)
  • 著者名/発表者名: 吉田利通
  • 学会等名: 第45回日本結合組織学会学術大会 第60回マトリックス研究会大会 合同学術大会
  • 発表場所: 和歌山
  • 年月日: 20130628-20130629
  • 招待講演
• [学会発表] 背部有茎穿通枝皮弁を用いた乳房再建術 (2013)
  • 著者名/発表者名: 花村典子、山下雅子、伊藤みのり、木村弘子、小川朋子
  • 学会等名: 日本乳癌学会
  • 発表場所: 浜松
  • 年月日: 20130627-20130629
• [学会発表] テネイシン－Ｃはインテグリンαvβ1/6を介して上皮間葉移行を誘導する (2013)
  • 著者名/発表者名: 吉田利通、下條直志、今中-吉田恭子
  • 学会等名: 第102回日本病理学会総会
  • 発表場所: 札幌
  • 年月日: 20130606-20130608
• [学会発表] 乳房温存手術における整容性を向上させる手技 NAC-recentralization (2013)
  • 著者名/発表者名: 花村典子、山下雅子、伊藤みのり、木村弘子、小川朋子
  • 学会等名: 日本外科学会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20130411-20130413
• [学会発表] Biological markers: as guidance for clinical decision in breast cancer treatment and their limits
  • 著者名/発表者名: Junichi Kurebayashi
  • 学会等名: Eisai Symposium of Contemporary Oncology
  • 発表場所: Jeju, Korea
  • 招待講演
• [学会発表] 乳癌に対する薬物療法の最新情報．
  • 著者名/発表者名: 紅林淳一
  • 学会等名: 第36回岡山県病院薬剤師会癌薬物療法研究会
  • 発表場所: 岡山
  • 招待講演
• [学会発表] 乳癌の内分泌療法
  • 著者名/発表者名: 紅林淳一
  • 学会等名: 第1回Breast Cancer Board Japan会議
  • 発表場所: 大阪
  • 招待講演
• [図書] ファーマナビゲーター SERM編 (2013)
  • 著者名/発表者名: 紅林淳一
  • 総ページ数: 10
  • 出版者: メディカルレビュー社 10
• [図書] これからの乳癌診療2013-2014 (2013)
  • 著者名/発表者名: 紅林淳一
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 金原出版株式会社
• [図書] オンコロジー・クリニカルガイド乳癌薬物療法 (2013)
  • 著者名/発表者名: 紅林淳一
  • 総ページ数: 10
  • 出版者: 南山堂
• [備考] 基礎医学系講座│修復再生病理学分野
  • URL: http://www.medic.mie-u.ac.jp/organization/course/pathol_matrix/