抗血栓性因子プロテインＳとＡＤＡＭＴＳ１３の研究を通した血栓症と血管障害症の解明

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24390250
• 研究機関: 独立行政法人国立循環器病研究センター
• 研究代表者: 宮田 敏行 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (90183970)
• 研究分担者: 小亀 浩市 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (40270730) ; 秋山 正志 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (30298179) ; 坂野 史明 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 研究員 (00373514)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 凝固制御因子 / 血小板 / プロテインS / ADAMTS13 / 血栓症

研究概要

私達は、プロテインＳ K196E変異が、静脈血栓塞栓症の遺伝的リスクであることを報告した。本研究では、プロテインS K196E変異体の簡便な測定系を開発し、変異保有者の同定を行ことを目的とした。前年度から、プロテインS K196E変異体を特異的に認識する単クローン抗体の作成を進め、今年度は変異Glu残基を含むペプチドに対する単クローン抗体の作製に成功した。すなわち、単クローン抗体をスクリーニングし、野生型Lys残基を含むペプチドには反応しない変異Glu残基特異的単クローン抗体３種を見いだした。次いで、血漿中のプロテインＳ K196E変異体の簡便な測定系を確立するため、変異特異的単クローン抗体を用いたELISA系の構築に取り組んでいる。このため、まず組み換えプロテインＳ K196E変異体をCHO細胞で発現させ精製した。３種の単クローン抗体は変性条件下ではプロテインＳ K196E変異体を強く認識するものの、生理的な条件下では結合が弱いことが判明した。現在、条件を検討している。
私達はADAMTS13遺伝子欠損マウスを作製しその血栓能を検討してきたが、今年度は電気通電による内皮細胞障害を伴う深部静脈血栓症モデルを用いて検討した。マウス下大静脈にステンレス電極を挿入して100μA・10分間通電した。電極の電気分解の結果生じるフリーラジカルにより、血管内皮細胞が活性化し、血栓形成が誘発される。生じる血栓が最大となる処置2日目に下大静脈内血栓を取り出し、その重量を測定した。ADAMTS13遺伝子欠損マウスの血栓重量は、野生型マウスより重い傾向を示したが有意差は見られなかった。
ADAMTS13のMDTCS領域の結晶構造解析のため、組み換えタンパク質を大量に調製した。単クローン抗体のFab断片との複合体の結晶化を進めている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

静脈血栓症の遺伝的リスクであるプロテインS K196E変異体の簡便な測定系の開発のため、変異特異的単クローン抗体（３種）の作成に成功した。静脈血栓の形成機構の最近の研究から、静脈血栓はフィブリンに加え血小板も関わることが明らかになってきた。今回、静脈血栓における血小板の関与を明らかにするため、ADAMTS13遺伝子欠損マウスを深部静脈血栓症モデルで血栓能を評価した。また、結晶化を目指してADAMTS13のMDTCS領域の大量調製を行った。

今後の研究の推進方策

今年度に作製したプロテインS K196E変異体特異的単クローン抗体を用いて、血漿中の変異体の簡便な測定系の確立を行う。すなわち、この単クローン抗体とポリクローナル抗体を用いてサンドイッチELISA系を組み、血漿中のプロテインS K196E変異体の定量システムを確立する。本法が確立すると、遺伝子を調べることなく、プロテインS K196E変異の有無を調べることが可能になる。プロテインS K196E変異ノックインマウスとプロテインS遺伝子欠損マウスでは、血管構築の異常による血管透過性の亢進などが考えられる。プロテインS遺伝子改変マウスの血液脳関門の機能を検査するため、中大脳動脈の閉塞後再灌流を行い、蛍光標識されたデキストランなどの低分子化合物を静注し、その漏出を２光子顕微鏡などで観察する。ADAMTS13の活性触媒領域を含むMDTCS領域や基質であるフォンビルブランド因子との相互作用部位を含むCUB領域の立体構造の解析を進める。

次年度の研究費の使用計画

研究はおおむね順調に進展し、当初の予定通りにプロテインS K196E変異に特異的な単クローン抗体の作製や、ADAMTS13 KOマウスの静脈血栓モデルでの解析などを進める事ができた。この間プラスティック製品や試薬などの消耗品の節約に努め、年度末には経費を次年度に持ち越すことができた。次年度に持ち越した研究経費は、遺伝子改変マウスの血管障害を調べるために行う組織染色（外注）などに有効に使用する予定である
血漿中のプロテインS K196E変異体に対するサンドイッチELISA系を組み立てるため、消耗品を購入する。国立循環器病研究センターで進行中の血栓症の研究に参加し、そこで収集される血漿を対象にELISAを行い、プロテインS K196E変異の有無を検討する。遺伝子改変マウスの微小循環系の可視化を通して血管透過性を調べ、血管障害を調べる。また、血管の組織染色を行う。組織染色は専門の業者に外注する予定である。ADAMTS13立体構造の決定のため、各種の組み換えタンパク質を発現する。こういった実験に必要な消耗品を購入する。情報収集・研究結果の発表のため、国内学会の旅費を支出する。複数の遺伝子改変マウスの維持と管理に研究費を支出する。

研究成果

• [雑誌論文] Dysfunction of protein C anticoagulant system, main genetic risk factor for venous thromboembolism in Northeast Asians. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yin T, Miyata T
  • 雑誌名: J Thromb Thrombolysis 巻: 37 ページ: 56-65
  • DOI: 10.1007/s11239-013-1005-x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nonsynonymous mutations in three anticoagulant genes in Japanese patients with adverse pregnancy outcomes. (2014)
  • 著者名/発表者名: Neki R, Miyata T, Fujita T, Kokame K, Fujita D, Isaka S, Ikeda T, Yoshimatsu J
  • 雑誌名: Thromb Res 巻: 133 ページ: 914-918
  • DOI: 10.1016/j.thromres.2014.02.012
  • 査読あり
• [雑誌論文] 非典型HUSにおける補体異常とその解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 吉田瑶子、藤村吉博、宮田敏行
  • 雑誌名: 細胞 巻: 46 ページ: 7-10
• [雑誌論文] 血栓性血小板減少性紫斑病 (2014)
  • 著者名/発表者名: 藤村吉博、松本雅則、石西綾美、八木秀男、小亀浩市、宮田敏行
  • 雑誌名: 臨床血液 巻: 55 ページ: 93-104
  • 査読あり
• [雑誌論文] ADAMTS13 activity and genetic mutations in Japan. (2013)
  • 著者名/発表者名: Miyata T, Kokame K, Matsumoto M, Fujimura Y
  • 雑誌名: Hamostaseologie 巻: 33 ページ: 131-137
  • DOI: 10.5482/HAMO-12-11-0017
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of genetic and predisposing factors in Japanese patients with atypical hemolytic uremic syndrome. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fan X, Yoshida Y, Honda S, Matsumoto M, Sawada Y, Hattori M, Hisanaga S, Hiwa R, Nakamura F, Tomomori M, Miyagawa S, Fujimaru R, Yamada H, Sawai T, Ikeda Y, Iwata N, Uemura O, Matsukuma E, Aizawa Y, Harada H, Wada H, Ishikawa E, Ashida A, Nangaku M, Miyata T, Fujimura Y
  • 雑誌名: Mol Immunol 巻: 54 ページ: 238-246
  • DOI: 10.1016/j.molimm.2012.12.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure and enzymatic activity of an ADAMTS-13 mutant with the East Asian-specific P475S polymorphism. (2013)
  • 著者名/発表者名: Akiyama M, Nakayama D, Takeda S, Kokame K, Takagi J, Miyata T
  • 雑誌名: J Thromb Haemost 巻: 11 ページ: 1399-1406
  • DOI: 10.1111/jth.12279
  • 査読あり
• [雑誌論文] Long term follow up of congenital thrombotic thrombocytopenic purpura (Upshaw-Schulman syndrome) on hemodialysis for 19 years: a case report. (2013)
  • 著者名/発表者名: Mise K, Ubara Y, Matsumoto M, Sumida K, Hiramatsu R, Hasegawa E, Yamanouchi M, Hayami N, Suwabe T, Hoshino J, Sawa N, Ohashi K, Kokame K, Miyata T, Fujimura Y, Takaichi K
  • 雑誌名: BMC Nephrol 巻: 14 ページ: 156
  • DOI: 10.1186/1471-2369-14-156
  • 査読あり
• [雑誌論文] Protein S K196E mutation, a genetic risk factor venous thromboembolism, is limited to Japanese. (2013)
  • 著者名/発表者名: Liu W, Yin T, Okuda H, Harada KH, Li Y, Xu B, Yang J, Wang H, Fan X, Koizumi A, Miyata T
  • 雑誌名: Thromb Res 巻: 132 ページ: 314-315
  • DOI: 10.10.16/j.thromres.2013.05.008
  • 査読あり
• [雑誌論文] Budd-Chiari Syndrome with multiple thrombi due to a familial Arg42Ser mutation in the protein C gene. (2013)
  • 著者名/発表者名: Muratsu J, Morishima A, Mizoguchi K, Ataka K, Yamamoto H, Fan X, Miyata T, Sakaguchi K
  • 雑誌名: Case Reports in Medicine 巻: 2013 ページ: 270419
  • DOI: 10.1155/2013/270419
  • 査読あり
• [雑誌論文] The integrin-linked kinase-PINCH-parvin complex supports integrin αIIbβ3 activation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Honda S, Shirotani-Ikejima H, Tadokoro S, Tomiyama Y, Miyata T
  • 雑誌名: PLos ONE 巻: 8 ページ: e85498
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0085498
  • 査読あり
• [雑誌論文] 先天性血栓性素因 (2013)
  • 著者名/発表者名: 宮田敏行、森下英理子
  • 雑誌名: 血栓と循環 巻: 21 ページ: 6-11
• [雑誌論文] 先天性ADAMTS13欠損症 (2013)
  • 著者名/発表者名: 宮田敏行、小亀浩市、小久保喜弘
  • 雑誌名: 臨床検査 巻: 57 ページ: 556-561
• [雑誌論文] 遺伝子改変血栓モデル：ADAMTS13遺伝子欠損マウスを中心に (2013)
  • 著者名/発表者名: 坂野史明、宮田敏行、藤岡政行、杉本充彦
  • 雑誌名: Thrombosis Medicine 巻: 3 ページ: 36-43
• [雑誌論文] Atypical HUSにおける補体制御異常症診断システムの構築と腎移植 (2013)
  • 著者名/発表者名: 芦田 明、吉田瑶子、範 新萍、松本雅則、服部元史、宮田敏行、藤村吉博
  • 雑誌名: 日本臨床腎移植学会雑誌 巻: 1 ページ: 39-44
  • 査読あり
• [雑誌論文] 非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS） (2013)
  • 著者名/発表者名: 藤村吉博、吉田瑶子、範 新萍、宮田敏行
  • 雑誌名: 臨床血液 巻: 54 ページ: 351-360
  • 査読あり
• [雑誌論文] 抗CFH抗体陽性およびCFHR1遺伝子欠失を伴うDEAP-HUSの１例 (2013)
  • 著者名/発表者名: 岡 政史、大塚泰史、稲田由紀子、佐藤忠司、吉田瑶子、藤村吉博、Fan Xinping、宮田敏行、濱崎雄平
  • 雑誌名: 日本小児腎臓病学会雑誌 巻: 26 ページ: 109-115
  • 査読あり
• [雑誌論文] 東アジア人特有のP475S変異を持つADAMTS13の立体構造と機能解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 秋山正志、武田壮一、宮田敏行
  • 雑誌名: 日本血栓止血学会誌 巻: 24 ページ: 613-618
  • 査読あり
• [学会発表] A long-term phenotype analysis of 51 patients with Upshaw–Schulman syndrome in Japan, with special references to pregnancy and renal failure that requires hemodialysis (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Fujimura, Yumi Yoshii, Masanori Matsumoto, Ayami Isonishi, Hideo Yagi, Koichi Kokame, Toshiyuki Miyata
  • 学会等名: 55th American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition
  • 発表場所: New Orleans, USA
  • 年月日: 20131207-20131210
• [学会発表] Atypical Hemolytic Uremic Syndrome In Japan Characterized By The Inhibitory Antibody-Based Hemolytic Assay and The Gene Analysis (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoko Yoshida, Xinping Fan, Yoshifumi Ohyama, Tetsuro Kokubo, Masanori Matsumoto, Hideo Yagi, Hiroko Shirotani-Ikejima, Toshiyuki Miyata, Yoshihiro Fujimura
  • 学会等名: 55th American Society of Hematology Annual Meeting and Exposition
  • 発表場所: New Orleans, USA
  • 年月日: 20131207-20131210
• [学会発表] 血栓性細小血管障害症の発症機構と診断・治療 (2013)
  • 著者名/発表者名: 宮田敏行
  • 学会等名: 第33回ヒューマンサイエンス基礎研究講習会
  • 発表場所: 吹田市
  • 年月日: 20130924-20130924
  • 招待講演
• [学会発表] 日本における先天性ADAMTS13欠損症の遺伝子解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 樋口（江浦）由佳, 小亀浩市, 松本雅則, 藤村吉博, 宮田敏行
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: 横浜市
  • 年月日: 20130911-20130913
• [学会発表] 凝固系・補体系の接点としての血管内皮細胞障害 (2013)
  • 著者名/発表者名: 宮田敏行
  • 学会等名: 第50回補体シンポジウム
  • 発表場所: 旭川市
  • 年月日: 20130705-20130706
  • 招待講演
• [学会発表] Registry of congenital atypical HUS in Japan (2013)
  • 著者名/発表者名: Yoshihiro Fujimura, Yoko Yoshida, Xinping Fan, Toshiyuki Miyata
  • 学会等名: XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis
  • 発表場所: Amsterdam,Netherlands
  • 年月日: 20130629-20130704
• [学会発表] Familial screening in the case of Budd-Chiari syndrome with multiple thrombi due to Arg42Ser mutation in the protein C gene (2013)
  • 著者名/発表者名: Jun Muratsu, Atsuyuki Morishima, Masayoshi Kukida, Anzu Tanaka, Xinping Fan, Toshiyuki Miyata, Katsuhiko Sakaguchi
  • 学会等名: XXIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis
  • 発表場所: Amsterdam, Netherlands
  • 年月日: 20130629-20130704
• [学会発表] 哺乳類細胞を用いたADAMTS13ドメインの一過性大量発現 (2013)
  • 著者名/発表者名: 平井秀憲、秋山正志、宮田敏行
  • 学会等名: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 鳥取市
  • 年月日: 20130612-20130614
• [学会発表] Pharmacogenomicsは抗血小板剤の個別化医療の救世主となり得るか？ (2013)
  • 著者名/発表者名: 宮田敏行、宮田茂樹、長束一行
  • 学会等名: 第35回日本血栓止血学会学術集会
  • 発表場所: 山形市
  • 年月日: 20130530-20130601
  • 招待講演
• [学会発表] ADAMTS13の正常な分泌にはシクロフィリンBによるプロリン残基異性化が必要である (2013)
  • 著者名/発表者名: 小亀浩市、秋山正志、宮田敏行
  • 学会等名: 第35回日本血栓止血学会学術集会
  • 発表場所: 山形市
  • 年月日: 20130530-20130601
• [図書] Annual Review 血液2014 (2014)
  • 著者名/発表者名: 宮田敏行、坂野史明
  • 総ページ数: 240
  • 出版者: 中外医学社
• [備考] 国立循環器病研究センター研究所分子病態部
  • URL: http://www.ncvc.go.jp/res/divisions/etiology/index.html