免疫淘汰圧に相乗効果を示す抗ウイルス剤の開発

2012 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24390254
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 児玉 栄一 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50271151)
• 研究分担者: 上野 貴将 熊本大学, エイズ学研究センター, 准教授 (10322314)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: ＨＩＶ / 抗ウイルス剤 / 免疫淘汰 / スクリーニング / アクセサリータンパク

研究概要

本研究は、多剤併用療法による治療効果をより安全かつ確実にするためにHIVが宿主免疫を回避する機能を解明・阻害することを目指す新規学術的基礎研究である。具体的には宿主細胞における免疫機能に重要なシグナル伝達の阻害、CD4やMHCなどの発現阻害を起こすHIVアクセサリタンパクNefに注目し、免疫回避に重要なdomainの詳細な機能解析と免疫回避機能を阻害しうる創薬研究を行う。
本年度は、アッセイ系の確立と発現細胞の選択のためにNefのレセプターdown-regulation活性をSEAP活性によって検出するアッセイ系を構築した。構築されたスクリーニング法を効果的に使用するために、培養期間、使用薬剤量、SEAP測定のためのサンプル量などと最適化させた。これまでに細胞内でSEAPの細胞外分泌シグナルを欠失させた変異体ではSEAPが細胞内にとどまり、それをTriton-X100添加で検出できることを明らかとしたが、さらなる改良を試みる。また、Nefにおけるシグナル伝達やCD4やMHCのdown-regulationに関与するドメインの変異体をsite directed mutagenesis法で作製し、Nef発現ベクターとpNL4-3を用いた分子クローンウイルスを作製し、これらの変異体がその機能を失っていることを確認した。複製能に関しては、その影響を受けるものとそうでないものに2つにわかれた。流行している臨床分離株のNef機能解析としてこれまでに無治療のHIV感染者約240例の検体を集め、解析を行った。平成25年度では目標としては500例以上を収集予定である。一部パイロット試験として、日本で流行しているNefの遺伝子配列を解析済みで、さらにHLA拘束性CTL応答と関連するNef変異の解析を進めている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

患者サンプルの収集など外的要因によって進捗の影響を受ける実験以外は、基本的には基礎的実験が主になるため、大きな遅れはないと考えられる。スクリーニング法も確立しつつあり、またスクリーニングのnegativeおよびpositive controlになる変異体ウイルスの作製もほぼ終わり、その性状確認を行っている。

今後の研究の推進方策

平成24年度は、臨床サンプルが十分に集まらなかったために一部の研究は遅れがでているが、今年度中には収集可能と推定され、今年度中に本格的な解析を開始する。他の実験に関しては予定通り進める。
患者サンプルの収集など外的要因によって進捗の影響を受ける実験に関しては平成25年度も継続して行うため、繰越申請を行っている。他の実験に関しては予定通りの使用計画である。

次年度の研究費の使用計画

Nef阻害剤のアッセイ系の確立やその検出に用いるベクター作製は概ね順調に進んではきているが、特徴的な臨床分離HIV株を平成24年度内に収拾しその解析を行うことが困難であった。その解析費用と計画していた冷凍庫の購入を延期したために基金分を平成25年度に繰り越した。
平成25年度に臨床分離HIVを少なくとも500株以上収拾し、その解析を終了させる。株数が増加したことにより冷凍庫を購入する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Attenuation of multiple Nef functions in HIV-1 elite controllers. (2013)
  • 著者名/発表者名: Mwimanzi P, Markle TJ, Martin E, Ogata Y, Kuang XT, Tokunaga M, Mahiti M, Pereyra F, Miura T, Walker BD, Brumme ZL, Brockman MA, Ueno T
  • 雑誌名: Retrovirology 巻: 10 ページ: 1
  • DOI: 10.1186/1742-4690-10-1
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dynamic range of Nef functions in chronic HIV-1 infection. (2013)
  • 著者名/発表者名: Philip Mwimanzi, Mark A Brockman and Takamasa Ueno
  • 雑誌名: Virology 巻: 439 ページ: 74-80
  • DOI: 10.1016/j.virol.2013.02.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mechanism of resistance to S138A substituted enfuvirtide and its application to peptide design. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kazuki Izumi, Kumi Kawaji, Fusasko Miyamoto, Kazuki Shimane, Kazuya Shimura, Yasuko Sakagami, Toshio Hattori, Kentaro Watanabe, Shinya Oishi, Nobutaka Fujii, Masao Matsuoka, Mitsuo Kaku, Stefan G. Sarafianos, and Eiichi N. Kodama
  • 雑誌名: Int. J. Biovjem. Cell Biol. 巻: 45 ページ: 908-915
  • DOI: .1016/j.biocel.2013.01.015
  • 査読あり
• [雑誌論文] Biochemical, inhibition, and inhibitor resistance studies of xenotropic murine leukemia virus-related virus reverse transcriptase. (2012)
  • 著者名/発表者名: TP. Ndongwe, AO. Adedeji, E Michailidis, YT Ong, A Hachiya, B Marchand, EM. Ryan, DK. Rai, KA. Kirby, AS. Whatley, DH. Burke, M Johnson, S Ding, YM Zheng, SL Liu, E Kodama, KA. Delviks-Frankenberry, VK. Pathak, H Mitsuya, MA. Parniak, K Singh, SG. Sarafianos.
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research 巻: 40 ページ: 345-359
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development and application of fluorescent SDF-1 derivatives. (2012)
  • 著者名/発表者名: Ryo Masuda, Shinya Oishi, Noriko Tanahara, Hiroaki Ohno, Akira Hirasawa, Gozoh Tsujimoto, Eiichi Kodama, Masao Matsuoka and Nobutaka Fujii
  • 雑誌名: Future Med Chem. 巻: 4 ページ: 837-844
  • 査読あり
• [雑誌論文] HIV-1 reverse transcriptase (RT) polymorphism 172K suppresses the effect of clinically relevant drug resistance mutations to both nucleoside and non-nucleoside RT inhibitors. (2012)
  • 著者名/発表者名: Atsuko Hachiya, Bruno Marchand, Karen A. Kirby, Eleftherios Michailidis, Xiongying Tu, Krzystof Palczewski, Yee Tsuey Ong, Daniel T. Griffin, Matthew M. Schuckmann, Junko Tanuma, Shinichi Oka, Kamalendra Singh, Eiichi N. Kodama and Stefan G. Sarafianos
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 287 ページ: 29988-29999
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.351551
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of translocation defective reverse transcriptase inhibitors on the activity of N348I, a connection subdomain drug resistant HIV-1 reverse transcriptase mutant. (2012)
  • 著者名/発表者名: Michailidis E, Singh K, Ryan EM, Hachiya A, Ong YT, Kirby KA, Marchand B, Kodama EN, Mitsuya H, Parniak MA, Sarafianos SG
  • 雑誌名: Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 巻: 58 ページ: 187-195
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of Small Molecule HIV-1 Fusion Inhibitors: Linking Biology to Chemistry. (2012)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto F, Kodama EN.
  • 雑誌名: Curr Pharm Des. 巻: 19 ページ: 1827-1834
  • 査読あり
• [雑誌論文] Minor contribution of HLA class I-associated selective pressure to the variability of HIV-1 accessory protein Vpu. (2012)
  • 著者名/発表者名: Hasan Z, Carlson JM, Gatanaga H, Le AQ, Brumme CJ, Oka S, Brumme ZL, Ueno T
  • 雑誌名: Biochem. Biophys. Res. Comm. 巻: 421 ページ: 291-295
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.04.002
  • 査読あり
• [雑誌論文] HLA class I down-regulation by HIV-1 Nef: What might we learn from natural sequence variants? (2012)
  • 著者名/発表者名: Mwimanzi P, Markle TJ, Ueno T, Brockman MA
  • 雑誌名: Viruses 巻: 4 ページ: 1711-1730
  • DOI: 10.3390/v4091711
  • 査読あり
• [学会発表] Reduced HIV-1 Nef Function in Acute/Early Individuals who become Viremic Controllers. (2013)
  • 著者名/発表者名: X. Kuang, A Le, P Mwimanzi, T Markle, R Danroth, T Ueno, T Miura, B Walker, Z Brumme, M Brockman, and the Acute HIV and International HIV Controllers study group.
  • 学会等名: The 20th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections (CROI)
  • 発表場所: Atlanta, USA
  • 年月日: 20130303-20130306
• [学会発表] The impact of a single amino acid difference in CDR3a on TCR ab cross-reactivity. (2012)
  • 著者名/発表者名: Chihiro Motozono, John S. Bridgeman, Masaaki Miyazawa, Andrew K. Sewell and Takamasa Ueno.
  • 学会等名: 第41回日本免疫学会総会・学術集会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 20121205-20121207
• [学会発表] Genetic and functional analyses of HIV-1 Nef in elite controllers. (2012)
  • 著者名/発表者名: Zafrul Hasan, J. Carlson, H. Gatanaga, A. Le, C. Brumme, S. Oka, Z. Brumme, Takamasa Ueno.
  • 学会等名: 第60回日本ウイルス学会学術集会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20121113-20121115
• [学会発表] Modulation of HIV-1 Nef-mediated HLA class I down-regulation activity during disease progression. (2012)
  • 著者名/発表者名: M. Mahiti, P. Mwimanzi, Y. Ogata, M. Tokunaga, B. Walker, Z. Brumme, M. Brockman, T. Ueno
  • 学会等名: 13th Kumamoto AIDS seminar
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 20121024-20121026
• [学会発表] Functional impairment of HIV-1 Nef in elite controllers and its correlation with immune-mediated selective pressure. (2012)
  • 著者名/発表者名: T. Ueno
  • 学会等名: 13th Kumamoto AIDS Seminar Global COE Joint International Symposium
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 20121024-20121026
• [学会発表] HIV-1 immune escape and cross-reactivity profiles of virus-specific cytotoxic T lymphocytes, YIS-A Session II. (2012)
  • 著者名/発表者名: Chihiro Motozono, John J. Miles, Zafrul Hasan, Hiroyuki Gatanaga, Meribe Stanley, Shinichi Oka, Masaaki Miyazawa, Andrew K. Sewell, Takamasa Ueno.
  • 学会等名: The13th Kumamoto AIDS Seminar Global COE Joint International Symposium
  • 発表場所: 熊本
  • 年月日: 20121024-20121026
• [学会発表] HLA-B35拘束性HIV特異的TCRは野生型抗原に高い特異性を有する (2012)
  • 著者名/発表者名: 本園千尋、John J. Miles、宮澤正顯、上野貴将、Andrew K. Sewell
  • 学会等名: 第21回組織適合性学会大会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20120915-20120917
• [学会発表] Impact of HLA class I-driven genetic variability in HIV-1 accessory gene vpu.
  • 著者名/発表者名: Zafrul Hasan, J. Carlson, H. Gatanaga, A. Le, S. Oka, Z. Brumme, Takamasa Ueno.
  • 学会等名: COLD SPRING HARBOR ASIA CONFERENCES: Frontiers of Immunology in Health and Disease.
  • 発表場所: 中国蘇州