白血病性幹細胞に対するキメラ抗原受容体を用いた遺伝子改変Ｔ細胞療法の開発

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24390260
• 研究機関: 信州大学
• 研究代表者: 小池 健一 信州大学, 医学部, 教授 (40143979)
• 研究分担者: 坂下 一夫 信州大学, 医学部附属病院, 講師 (10345746) ; 中沢 洋三 信州大学, 医学部, 助教 (60397312)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 白血病性幹細胞 / 免疫療法 / 小児白血病 / 骨髄異形成症候群

研究概要

白血病性幹細胞に発現しているサイトカイン受容体（GM-CSF receptor,GM-CSFR）に結合して特異的な殺傷効果を示すキメラ抗原受容体（CAR）T細胞療法の開発を行った。GM-CSFRに結合するGM-CSFのopen reading frameをトランスポゾンプラスミドにサブクローニングし、piggyBacトランスポゾン法を用いて正常同種T細胞へ遺伝子導入した (GMCSFR.CAR-T)。コントロールとして、非導入T細胞 (Mock-T)を用いた。
CD3/CD28刺激とIL-15により体外増幅されたGMCSFR.CAR-T細胞をflow cytometryで解析した結果、約85%はCD8陽性で、NK細胞はほとんど含まれていなかった。GMCSFR.CAR-T細胞は、GM-CSFRを発現しているMO7e細胞に対して、E/T比＝1:1で明らかな殺傷効果を発揮したが、GM-CSFRを発現していないK562白血病細胞の増殖には影響を及ぼさなかった。GMCSFR.CAR-T細胞とNRAS変異を有する2 名のJMML患者のCD34陽性細胞を1:1、1:4で混和し、SCF、TPO、IL-3存在下で、2日間および7日間培養し、コロニー数を算定した。GMCSFR.CAR-T細胞はE/T比が1:1だけでなく1:4でもJMML患者CD34陽性細胞から形成されるコロニー数を約10%に減少させたのに対して、Mock-T細胞では明らかなコロニー数の減少は認められなかった。GMCSFR.CAR-T細胞はPTPN11変異(227A>G)を有するJMML患者のCD34陽性細胞に対しても、NRAS変異を有するJMML患者のCD34陽性細胞と同等の殺傷効果を示した。GMCSFR.CAR-TはGM-CSFのopen reading frameから作製したため、SCF、TPO、GM-CSF刺激下においても殺傷効果を発揮するのかを検討した。その結果、SCF、TPO、IL-3刺激下と同等に、NRAS、PTPN11変異を持つJMML患者のCD34陽性細胞に対して抑制効果を示した。また、NRAS変異を有するJMML患者から作成したGMCSFR.CAR-T細胞は、自身のCD34陽性細胞に対して明らかな殺傷効果を示した。一方、臍帯血由来の正常CD34陽性細胞に対しては明らかな殺傷効果を示さなかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究実績の概要に記述したように、GM-CSF受容体に対して特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）T細胞が作製できたこと、このGMCSFR.CAR-T細胞がJMML細胞に対して明らかな殺傷効果を示したため。

今後の研究の推進方策

JMML患者の数を増やして検討する。また、正常造血幹細胞に対する殺傷効果があるのか否かは極めて重要なため、骨髄・末梢血造血幹細胞に対する影響も詳細に解析する。さらに、AML患者由来の白血病細胞についてもGM-CSF-CAR-T細胞などCAR-T細胞のin vitro、in vivo殺傷効果を検討する。

次年度の研究費の使用計画

当初計画で見込んだよりも安価に研究が完了したため、458,607円の次年度使用額が生じた。
患者の白血病細胞に対するGM-CSFR-CAR-T細胞の殺傷効果と、正常人骨髄幹細胞に対するGM-CSFR-CAR-T細胞の殺傷効果を比較検討し、GM-CSFR-CAR-T細胞の殺傷効果が白血病細胞特異的か否か等を明らかにするため、平成25年度に生じた残額と平成26年度経費を合わせて使用する計画である。

研究成果

• [雑誌論文] Myeloid progenitors with PTPN11 and non-RAS pathway gene mutations are refractory to treatment with 6-mercaptopurine in juvenile myelomonocytic leukemia. (2014)
  • 著者名/発表者名: Matsuda K, Nakazawa Y, Iwashita C, Kurata T, Hirabayashi K, Saito S, Tanaka M, Yoshikawa K, Yanagisawa R, Sakashita K, Sasaki S, Honda T, Koike K.
  • 雑誌名: Leukemia 巻: 28 ページ: 1545-8
  • DOI: 10.1038
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Analysis of Class I and II Aberrations in Iraqi Childhood Acute Myeloid Leukemia Using Filter Paper Cards. (2014)
  • 著者名/発表者名: Al-Kzayer LF, Uyen LT, Al-Jadiry MF, Al-Hadad SA, Al-Badri SA, Ghali HH, Ameen NA, Liu T, Matsuda K, Abdulkadhim JM, Al-Shujairi TA, Matti ZI, Hasan JG, Al-Abdullah HM, Al-Ani MH, Saber PA, Khalil HM, Inoshita T, Kamata M, Koike K, Sakashita K.
  • 雑誌名: Annals of Hematology 巻: 2014 Jan 25 ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Usefulness of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in first complete remission for pediatric blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm with skin involvement: a case report and review of literature. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sakashita K, Saito S, Yanagisawa R Miyuki Tanaka M, Yoshikawa K, Hirabayashi K, Tsukahara K, Motobayashi M, Nakazawa Y, Koike K.
  • 雑誌名: Pediatr Blood Cancer 巻: 60 ページ: E140-2
  • DOI: 10.1002/pbc.24622
  • 査読あり
• [雑誌論文] Successful cord blood transplantation after repeated transfusions of unmobilized neutrophils in addition to antifungal treatment in an infant with chronic granulomatous disease complicated by invasive pulmonary aspergillosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shigemura T, Nakazawa Y, Yoshikawa K, Hirabayashi K, Saito S, Kobayashi N, Sakashita K, Shiohara M, Wada T, Shimodaira S, Agematsu K and Koike K.
  • 雑誌名: Transfusion 巻: 54 ページ: 516-21
  • DOI: 10.1111/trf.12325
  • 査読あり
• [雑誌論文] Replaced platelet concentrates containing a new additive solution, M-sol: safety and efficacy for pediatric patients. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yanagisawa R, Shimodaira S, Kojima S, Nakasone N, Ishikawa S, Momose K, Honda T, Yoshikawa K, Saito S, Tanaka M, Nakazawa Y, Sakashita K, Shiohara M, Akino M, Hirayama J, Azuma H, Koike K.
  • 雑誌名: Transfusion 巻: 53 ページ: 2053-60
  • DOI: 10.1111/trf.12025.
  • 査読あり
• [学会発表] 接合菌特異的定量ＰＣＲによる接合菌症血清診断法の検討 (2014)
  • 著者名/発表者名: 重村倫成、小池 健一、他
  • 学会等名: 第36回日本造血細胞移植学会総会
  • 発表場所: 沖縄コンベンションセンター
  • 年月日: 20140307-20140309
• [学会発表] HLA-DRB1不一致同胞間造血幹細胞移植後に不一致アリルの消失を伴って再発した急性リンパ性白血病の1例 (2014)
  • 著者名/発表者名: 倉田 敬、小池 健一、他
  • 学会等名: 第36回日本造血細胞移植学会総会
  • 発表場所: 沖縄コンベンションセンター
  • 年月日: 20140307-20140309
• [学会発表] 若年性骨髄単球性白血病に対するGM-CSF受容体を標的とした遺伝子改変T細胞療法の開発 (2013)
  • 著者名/発表者名: 中沢 洋三、小池健一、他
  • 学会等名: 第55回日本小児血液・がん学会学術集会
  • 発表場所: ヒルトン福岡シーホーク
  • 年月日: 20131129-20131201
• [図書] 『今日の診断指針』第7版 小児の貧血 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小池健一
  • 総ページ数: 印刷中
  • 出版者: 医学書院
• [図書] 『今日の治療指針』2014年度版 (2014)
  • 著者名/発表者名: 小池健一
  • 総ページ数: 印刷中
  • 出版者: 医学書院
• [図書] ネルソン小児科学第19版（翻訳）小児の組織球増殖疾患 (2014)
  • 著者名/発表者名: 中沢洋三、小池健一
  • 総ページ数: 印刷中
  • 出版者: エルゼビアジャパン