| 研究課題/領域番号 |
24390351
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
内田 研造 福井大学, 医学部, 准教授 (60273009)
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| 研究分担者 |
馬場 久敏 福井大学, 医学部, 教授 (00165060)
中嶋 秀明 福井大学, 医学部, 助教 (10397276)
牛田 亨宏 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60304680)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 脊髄損傷 / 神経障害性疼痛 / 遺伝子解析 / 画像解析 / 活性型ミクログリア |
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| 研究概要 |
【慢性疼痛モデルにおける疼痛関連因子の発現解析の方法及び結果】
脊髄損傷疼痛モデルとしては、C57BL6マウスを使用し、IH impactorを用いて60KdynのT9高位に圧挫損傷を加えモデルを作成した。損傷後3日の時点で培養したマウスBMSC 1.0×105個を損傷部に移植した群をBMSC群、mediumのみ移植した群をcontrol群とした。運動機能検査にBMS scale、痛覚検査にUgo Basile社製のvon Frey装置、足底熱刺激測定(plantertest)装置を用いて損傷後1週目から1週おきに6週まで行動学的評価を行った。損傷後2週、4週、6週の時点で脊髄凍結切片を作成し、蛍光免疫染色でIba-1、NeuN、GFAPで細胞を、疼痛関連物質として、MAPKにおけるp38、ERK、JNKを用いて評価した。BMSC群では運動機能は有意に改善がみられた。圧刺激に対する閾値はBMSC群で改善傾向であったが、有意差はみられなかった。また、熱刺激に対する閾値は経過中ほとんど改善がみられず、各群間で有意差はみられなかった。慢性期損傷後2週以降では、免疫染色においてP38は主にmicrogliaで、ERK、JNKはastrocyteで発現がみられWestern Blotting法の結果ではBMSC群ではこれらの蛋白の低下がみられた。
【慢性疼痛モデルにおける活性化ミクログリアの可視化の方法及び結果】
C57BL6マウスにGFP transgenicマウスの骨髄細胞移植を施し、キメラマウスを作成、脊髄損傷後3日の時点で培養したhBMSC2.0×105個を損傷部に移植した。移植後1, 4, 7, 14日の時点で脊髄凍結切片を作成し、蛍光二重染色で1次抗体にIba-1、CDllb、PBRを用いることで経時的に評価した。またmicrogliaの定量化のためFACSを用いた。上記のマウスの標本にInMに調節した3H-(R)PK11195を反応させ、micro-autoradiographyの手技で損傷脊髄におけるPK11195の集積を経時的に評価した。免疫染色およびFACSではmicrogliaは移植後4日まで上昇がみられ、以降は漸減していった。hBMSC投与群ではこの上昇が抑制され、有意なmicrogliaの上昇を認めなかった。PK11195は主に脊髄灰白質に分布しており、損傷後4日で集積のピークがみられたが以降は漸減するものの、有意な低下は見られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度以降に行う予定であったサル脊髄損傷モデルの作成を平成24年度から始め、作成手技を習得するために実験動物中央研究所へ行った。また、損傷脊髄内での微小環境測定のため当初予定になかった以下の機器を購入いたしました。
・レーザ血流計ALF21Nアドバンス株式会社
・微量生体試料分析システムHTEC-500株式会社エイコム
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| 今後の研究の推進方策 |
平成25年度はマウス脊髄損傷・疹痛モデルに対する骨髄幹細胞移植後の活性型マイクログリアに関する組織学的・分子生物学的検討を、平成26年度はサル脊髄損傷・疹痛モデルを用いた脊髄ニューロイメージング(^<11>C-PK11195-PET,^<18>FDG-PET)による可視化・定量化の検討を行う。
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