| 研究課題/領域番号 |
24390351
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
内田 研造 福井大学, 医学部, 准教授 (60273009)
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| 研究分担者 |
馬場 久敏 福井大学, 医学部, 教授 (00165060)
中嶋 秀明 福井大学, 医学部, 助教 (10397276)
牛田 享宏 愛知医科大学, 医学部, 教授 (60304680)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 脊髄損傷 / 神経障害性疼痛 / 遺伝子解析 / 画像解析 / 活性型ミクログリア |
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| 研究概要 |
【慢性疼痛モデルにおける疼痛関連因子の発現解析と行動学的評価】
H24-25年度にかけて、マウス胸髄損傷モデルのサンプルを用いてGene Chip（Microarray法）解析・リアルタイムRT-PCRにより、Gene Ontology解析、pathway 解析（KEGG pathway解析）を行った結果、MAPKにおけるp38-MAPK、ERK、JNKなどの疼痛関連物質が脊髄障害性疼痛に関与していることが示された。今年度(H25年度)は特に免疫組織学的検討と行動学的評価を詳細に観察した。まずそれらの蛋白の局在が主に、activated microglia/macrophage (M/M)に一致しており、その病態の主因であることが示された。行動学的評価では、BMS scale、von Frey test、planter testともに損傷後２週で有意に低下しており、この神経障害性疼痛の評価は、損傷部位の胸髄後角ニューロンにおけるp-CREB、PKC-γの発現増加と一致していた。
【GFP transgenicマウスの骨髄由来幹細胞移植を行ったキメラマウスを用いた活性化ミクログリア・マクロファージ(M/M)の観察】
H24年度には骨髄由来幹細胞（BMSC）により、活性化M/Mの抑制効果を確認したことを受け
H25年度は、この活性化M/Mの由来を同定するために、キメラマウス胸髄損傷モデルを用いて、免疫組織化学的検討を行った。損傷により損傷部位の胸髄後角ニューロンにおけるp-CREB、PKC-γの発現が増加していた。CD11b陽性細胞は損傷により増殖し、その大多数において, p38-MAPK, ERKの発現がみられた。CD11b-GFP二重陽性細胞（骨髄由来マクロファージ）、およびCD11b陽性-GFP陰性細胞（resident microglia：脊髄由来ミクログロア）ともに、MAPK (p-38, ERK)を強く発現していた。これらの定量化はフローサイトメトリーでも確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
【マウス脊髄障害性疼痛モデルの分子生物学的病態解析とオートラジオグラフィー法による疼痛の客観的評価】
H24-25年度の２年間においてマウス脊髄損傷疼痛モデルを作成し、その妥当性を確認した。免疫組織学的評価では、損傷部位( at level)での脊髄後角ニューロンにおいてのMAPK pathwayの転写因子であるp-CREB、PKC-γの発現を確認し、神経障害性疼痛であることが組織学的に確認された。また、約２週で、von Frey test、planter testともに損傷後２週で有意に低下し、過去のマウス脊髄損傷疼痛モデルの報告とほぼ一致していていた。脊髄障害性疼痛の原因遺伝子を特定のために、Microarray解析・RT-PCRにて解析したところ特に損傷後２週以降においてPKA, ERK, p38-MARK, SP, CGRP, BDNF, PKCγなど遺伝子発現が確認された。この中で有意な発現を認めていたMAPK pathwayの中からp38-MAPK, p-ERKがGFP-キメラマウス損傷モデルにてミクログリア、マクロファージの両方に発現していた。障害性疼痛の可視化については、オートラジオグラフィー法により活性型M/Mとの組織学的検証を行い、3H-(R)PK11195は、ミクログリアの細胞マーカーであるIba-1、CD11b、PBR の局在とほぼ一致していた。
【マウス脊髄障害性疼痛モデルに対する骨髄幹細胞移植(BMSC)治療効果】
損傷後３日目の損傷部位への細胞移植により、移植後２週において行動学的評価、組織学的評価（p38-MAPK, p-ERK, p-CREMの抑制）、フローサイトメトリーにて確認した。
以上、この２年間の研究課題はほぼ達成しており、これらの結果は、国内の関連学会(H25年度日本整形外科学会基礎学会、日本脊椎脊髄病学会、日本運動器疼痛学会など)に発表済みである。
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| 今後の研究の推進方策 |
【脊髄障害性疼痛におけるニューロイメージング】
この2年間のAutoradiography法の検討により、3H-(R)PK11195は、ミクログリアの細胞マーカーである可能性が示唆された。来年度は、C-11 PK11195-PET、FDG-PETにて、マウス・あるいはラット脊髄損傷モデルに対して、脳および局所の脊髄撮像を施行する。今年度は標準脳・脊髄摂取量（SUV）と行動学的評価、組織学的評価と比較検討する予定である。
【骨髄由来幹細胞の治療効果のメカニズム】
これまでの結果では、損傷後3-7日で、CD11b陽性細胞の増殖、および MAPK (p38-MAPK, p-ERK)の強発現を認め、これに対して細胞移植群では、その抑制効果（CD11陽性細胞数の減少、MAPK蛋白発現の減少）が示された。しかしながら、興味あることにキメラマウス胸髄損傷モデルの組織学的検討では、細胞移植群において、CD11b-GFP二重陽性細胞（骨髄由来マクロファージ）が減少するのにかかわらず、CD11b陽性-GFP陰性細胞（resident microglia：脊髄由来ミクログリア）は増加していた。脊髄損傷においては、blood-spinal cord barrier(BSCB)機能の破綻は炎症細胞浸潤を引き起こし、脊髄損傷後の疼痛に関与していると考えられる。この幹細胞移植後の結果は、１）移植した幹細胞によりBSCBの破綻が修復された可能性、２）幹細胞のもつ抗炎症・抗免疫効果が作用した可能性が考えられる。今後、BSCB透過性の変化(Albmin、PDGFR-α)による組織学的観察および、pro-inflammatory cytokines (TNF-α、IL-6、MMP-9)、chemokines(CCL2、CCL5、CXCL10)について、移植後の免疫組織学検討により、骨髄由来幹細胞の治療効果のメカニズムについて更に研究を進める予定である。
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