軟骨細胞増殖/分化を制御する新たなメカニズムの同定と解析

2012 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24390354
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 妻木 範行 京都大学, iPS細胞研究所, 教授 (50303938)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: chondrocyte / dedifferentiation / knockout mice / Col11a2 / SIK3

研究概要

軟骨細胞の形質を保つ因子を同定するためのスクリーニングを行った。XI型コラーゲンα2鎖遺伝子(Col11a2)のプロモーター・エンハンサーは硝子軟骨特異的発現をもたらす。EGFP遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子をIRES配列でつないだレポーターを、Col11a2プロモーター・エンハンサー配列に結合したトランスジーンコンストラクト(Col11a2-EGFP-Puro)を持つトランスジェニックマウスから真皮線維芽細胞(MDF)を培養した。Col11a2-EGFP-PuroMDFにc-Myc,Klf4,Sox9をドキシサイクリン発現誘導システムを使って導入し、軟骨細胞様細胞を誘導した。誘導軟骨細胞様細胞からドキシサイクリンを除去し、DMEM+10%FBS培地で培養して細胞を脱分化させる系を作った。この培養系に、転写因子とシグナル分子をコードしたcDNAライブラリーを導入し、軟骨細胞の形質維持に貢献する因子を探索した。ファーストスクリーニングを半数終え、約10個の候補遺伝子を得た。同培養系を用いて、shRNAライブラリーと化合物ライブラリーのスクリーニングも並行して行い、軟骨細胞の形質を維持するためにターゲット因子の探索も開始した。得られた候補因子、化合物を、脱分化させた初代軟骨細胞培養に投与し、軟骨細胞の形質回復に作用するか否かを2次スクリーニングとして検証することを行っている。検証には、Col11a2-EGFPのGFPレポーターの蛍光、および軟骨細胞マーカーの発現を解析する。また、SIK3遺伝子が軟骨細胞の肥大化に係っていることを突き止めた。SIK3の阻害が関節軟骨に与える影響を調べるために、生後のマウスの関節軟骨でSIK3を欠失するconditional knockoutマウスの作製を行った。SIK3 floxマウスの作製は、キメラマウスを得た。今後neoカセットをflpで欠失させたのち、軟骨特異的Cre-ERマウスと交配する予定である。軟骨特異的Cre-ERマウスとして、Col11a2-CreERマウスを樹立し、関節軟骨でloxPサイトで組み換えられることを、レポーターマウスを使って検証している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

軟骨細胞の形質を保つ因子を同定するためのスクリーニング系を作り、スクリーニングを開始して候補因子を得つつある。また、軟骨細胞の肥大化に関与する因子としてSIK3に焦点を当て、その欠失が関節軟骨に与える影響をコンディショナルノックアウトマウスを使って調べるための準備を行っている。

今後の研究の推進方策

軟骨細胞の形質維持に係る因子のスクリーニングと解析を引き続き行う。軟骨細胞脱分化の過程をタイムラプス撮影により解析する。SIK3ノックアウトマウスの軟骨細胞で肥大化遅延が起こる分子メカニズムを解析する。

研究成果

• [雑誌論文] Involvement of SIK3 in glucose and lipid homeostasis in mice (2012)
  • 著者名/発表者名: Uebi, T., Itoh, Y., Hatano, 0., Kumagai, A., Sanosaka, M., Sasaki, T., Sasagawa, S., Doi, J., Tatsumi, K., Mitamura, K., Morii, E., Aozasa, K., Kawamura, T., Okumura, M., Nakae, J., Takikawa, H., Fukusato, T., Koura, M., Nish, M., Hamsten, A., Silveira, A., Bertorello, A. M., Kitagawa, K., Nagaoka, Y., Kawahara, H., Tomonaga, T, , Naka, T., Ikegawa, S., Tsumaki, N., Matsuda, J. and
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 7
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0037803
  • 査読あり
• [雑誌論文] An Overgrowth Disorder Associated with Excessive Production of cGMP Due to a Ga i n-of-Function Mutation of the Natriuretic Peptide Receptor 2 Gene (2012)
  • 著者名/発表者名: Miura, K., Namba, N., Fujiwara, M., Ohata, Y., Ishida, H., Kitaoka, T., Kubota, T. , Hirai, H., Higuchi, C., Tsumaki, N., Yoshikawa, H., Sakai, N., Michigami, T. and Ozono, K.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 7
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0042180
  • 査読あり
• [雑誌論文] Osterix regulates calcification and degradation of chondrogenic matrices through matrix metalloproteinase 13 (MMP13) expression in association with transcription factor Runx2 during endochondral ossification (2012)
  • 著者名/発表者名: Nishimura, R., Wakabayashi, M., Hata, K., Matsubara, T., Honma, S., Wakisaka, S. .Kiyonari, H., Shioi, G., Yamaguchi, A., Tsumaki, N., Akiyama, H. and Yoneda, T
  • 雑誌名: J. Biol. Chem 巻: 287 ページ: 33179-33190
  • DOI: 10.1074/jbc.Mill.337063
  • 査読あり
• [学会発表] 軟骨細胞増殖・分化におけるCyp26bl遺伝子の機能解明 (2013)
  • 著者名/発表者名: 峯岸芳樹
  • 学会等名: 第7回Bone Research Seminar
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 2013-02-15
• [学会発表] 細胞のタイプを変える-いくつになっても走れるのか? (2013)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 富田林高校 出前授業
  • 発表場所: 富田林(招待講演)
  • 年月日: 2013-02-01
• [学会発表] 細胞リプログラミングによる軟骨疾患治療と再生 (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 第40回日本関節病学会
  • 発表場所: 鹿児島
  • 年月日: 20121108-20121109
• [学会発表] 細胞リプログラミング技術による軟骨疾患治療 (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 日本整形外科学会 基礎学術集会 シンポジウム
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 20121026-20121027
• [学会発表] 再生医療の最前線-軟骨疾患をターゲットとして (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 第46回日本小児内分泌学会学術集会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20120927-20120929
• [学会発表] In vivo and In vitro Modeling of Type II Collagenopathy using Cell Reprogramm Technologies (2012)
  • 著者名/発表者名: 岡田 稔
  • 学会等名: 第13回運動器科学研究会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 20120914-20120915
• [学会発表] 軟骨細胞増殖・分化におけるCyp26blの役割 (2012)
  • 著者名/発表者名: 峯岸 芳樹
  • 学会等名: 第13回運動器科学研究会
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 20120914-20120915
• [学会発表] 軟骨細胞増殖・分化に及ぼすCyp26bl遺伝子の機能の解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 峯岸芳樹、吉川秀樹、妻木範行
  • 学会等名: 第30回日本骨代謝学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20120719-20120721
• [学会発表] カレントコンセプト:軟骨細胞リプログラミングによる関節軟骨疾患の治療戦略 (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 第30回日本骨代謝学会
  • 発表場所: 東京(招待講演)
  • 年月日: 20120719-20120721
• [学会発表] Meet the Expert: 軟骨マトリックス転写活性を指標にした、細胞リプログラミングによる (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 第30回日本骨代謝学会
  • 発表場所: 東京(招待講演)
  • 年月日: 20120719-20120721
• [学会発表] 皮膚線維芽細胞から軟骨細胞様細胞へのダイレクト・リプログラミング (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 第33回日本炎症・再生医学会
  • 発表場所: 博多
  • 年月日: 20120705-20120706
• [学会発表] 皮膚細胞培養から軟骨を作る試み (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 第54回日本老年医学会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20120628-20120630
• [学会発表] Generation of induced chondrogenic cells directly from dermal fibroblast culture by defined factors (2012)
  • 著者名/発表者名: Noriyuki Tsumaki
  • 学会等名: Internatinal Conference on Bone Morphogenetic Protein
  • 発表場所: Lake Tahoe, CA, USA
  • 年月日: 20120619-20120623
• [学会発表] Chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells (2012)
  • 著者名/発表者名: Okada, M. ; Tsumaki, N
  • 学会等名: International Society for Stem Cell Research 10th annual meeting
  • 発表場所: Yokohama
  • 年月日: 20120613-20120616
• [学会発表] Regulation of differentiation and cell reprogramming of chondrocytes (2012)
  • 著者名/発表者名: Noriyuki Tsumaki
  • 学会等名: Cold Spring Harbor Asia Conference, Bone and Cartilage
  • 発表場所: Suzhou Dushu, China
  • 年月日: 20120611-20120615
• [学会発表] Roles of Cyp26bl in endochondral bone formation (2012)
  • 著者名/発表者名: Minegishi, Y. Sakai, Y. Hosokawa, K. ;Yoshikawa, H. I Tsumaki, N
  • 学会等名: Cold Spring Harbor Asia Conference, Bone and Cartilage
  • 発表場所: Suzhou Dushu, China
  • 年月日: 20120611-20120615
• [学会発表] 軟骨細胞分化制御と再生医療における軟骨細胞ソースの開発 (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 骨代謝セミナー
  • 発表場所: 東京(招待講演)
  • 年月日: 2012-12-21
• [学会発表] 細胞リプログラミング技術を用いた軟骨疾患モデリング (2012)
  • 著者名/発表者名: 岡田稔、妻木範行
  • 学会等名: 第5回胎児骨系統疾患フォーラム
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 2012-12-02
• [学会発表] 細胞リプログラミング技術を用いたII型コラーゲン病疾患モデルの解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 岡田稔、妻木範行
  • 学会等名: 第9回Skeletal Research Meeting
  • 発表場所: 京都
  • 年月日: 2012-11-10
• [学会発表] 再生医療の最前線～軟骨疾患をターゲットとして (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 第176回医学セミナー
  • 発表場所: 藤田保健衛生大学(愛知)(招待講演)
  • 年月日: 2012-10-03
• [学会発表] 軟骨細胞分化制御と細胞リプログラミング (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 第7回岡山骨・関節セミナー
  • 発表場所: 岡山(招待講演)
  • 年月日: 2012-09-20
• [学会発表] 細胞リプログラミングと軟骨疾患の再生 (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木 範行
  • 学会等名: 第2回細胞再生医療研究会
  • 発表場所: 神戸(招待講演)
  • 年月日: 2012-07-29
• [図書] NEWエッセンシャル整形外科、第1章 (1) 骨 (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木範行
  • 総ページ数: 18
  • 出版者: 医歯薬出版株式会社
• [図書] Locomotive Pain Frontier Vol 1, No 1 整形外科と細胞リプログラミング (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木範行
  • 総ページ数: 2
  • 出版者: メディカルレビュー社
• [図書] 臨床整形外科「視座」整形外科医、基礎研究、生き物 Vol.47, No. 5 (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木範行
  • 出版者: 医学書院
• [図書] 特集1.骨代謝研究におけるエピゲノムの最先端:真皮線維芽培養細胞から軟骨細胞様細胞へのダイレクト・リプログラミング (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木範行
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: CLINICAL CALCIUM
• [図書] 再生医療叢書6、骨格系。多能性幹細胞を使った軟骨再生。(日本再生医療学会) (2012)
  • 著者名/発表者名: 岡田稔、妻木範行
  • 総ページ数: 12
  • 出版者: 朝倉書店
• [図書] iPS細胞を経ない皮膚細胞から軟骨細胞への誘導。 リウマチ病セミナーXXIII (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木範行
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: 永井書店
• [図書] 軟骨細胞の分化制御機構と軟骨再生 (2012)
  • 著者名/発表者名: 妻木範行
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: ニューサイエンス社