| 研究課題/領域番号 |
24390420
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| 研究機関 | 島根大学 |
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研究代表者 |
石橋 浩晃 島根大学, 医学部, 准教授 (90254630)
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| 研究分担者 |
鬼丸 満穂 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00380626)
中山 英二 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (60172467)
杉本 直俊 金沢大学, 医学系, 准教授 (80272954)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 悪性新生物 / 血管新生 / 遺伝子治療 / 転写因子 |
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| 研究概要 |
現在まで申請者は培養口腔扁平上皮癌細胞の血管新生機構を制御している転写因子として，Sp1やHIF-1の重要性について検証した．すなわち，SAS細胞やTF細胞をNFで刺激すると，刺激直後よりSp1の活性化を認め，検索した30分間は継続した．この癌細胞におけるSp1活性がVEGFやTGFβ１，PDGF，組織因子(TF)などの血管新生因子群の発現誘導に関与している可能性が高いと思われる．さらに，Sp1はuPAなどの基質破壊酵素の発現にも関与しているとされており，Sp1抑制は血管新生抑制だけでなく，基質破壊も制御し癌の浸潤を抑制できる可能性があると期待できる．そこで，当該年度は動物モデルにおける実験的腫瘍においても，Sp1の活性化がみられるか検証するとともに，Sp1を標的としたおとり遺伝子をHVJ―リポソーム法により遺伝子導入し，Sp1の転写活性の抑制効果についてバンドシフトアッセイにより検証した．さらに，ヌードマウスに作成した実験的腫瘍について，ルシフェラーゼ発現プラスミド（pcDNA3-luciferase），あるいはFITC標識した合成オリゴヌクレオチドを用いて，HVJ-リポソーム法により実験的腫瘍に遺伝子導入した．その後，腫瘍組織を切除してルシフェラーゼ活性の定量的解析や，蛍光顕微鏡による病理組織学的検証により，以下に記載する導入条件を中心として，最良の導入効率となる至適遺伝子導入条件を確立した．（1)導入間隔：HVJ―リポソーム法は反復導入が極めて容易であり，遺伝子発現が最大となる導入間隔を決定した．(2)導入部位：癌細胞に大量におとり遺伝子を導入するために，有効な投与経路を検索した．(3)導入量： 培養細胞への遺伝子導入条件を資料として，動物モデルへの遺伝子導入に関わる至適力価を確立した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまで展開してきた培養癌細胞における血管新生因子の発現機構に関する知見を基礎に，HVJ-リポソーム法によるおとり遺伝子導入が，これらの血管新生因子の抑制に有効である可能制が示唆できた．また，HVJ―リポソーム法による口腔扁平上皮癌細胞へのおとり遺伝子の導入条件を確立でき，従来のリポソームと比較して 800-1000倍の導入効率を示すことを検証できた．また，培養細胞系におけるおとり遺伝子導入の至適条件を背景に，動物モデルに作成した実験的腫瘍における遺伝子導入条件の確立とその検証を行う基盤が整備できた．
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| 今後の研究の推進方策 |
血管新生には多彩な転写因子群の関与が考えられる．そこで，培養口腔癌細胞を用いて，Sp1以外の転写因子群（AP-1，NF-kB，Ets-1，HIF-1）についても検討する．培養癌細胞においても多彩な転写因子が活性化しており，転写因子AP-1はEGF共存下や低酸素環境により，VEGFやuPA，uPARの発現誘導に関与している可能制がある．そこで，動物モデルにおける実験的腫瘍においても，Sp1を標的としたおとり遺伝子導入がやはり有効なのか，あるいはAP-1など，他の転写因子に対するおとり遺伝子の抑制効果も期待できるのか検討する．さらに，現在までは標的転写因子を単一にして検証してきたが，例えばSp1とAP-1に対するおとり遺伝子のカクテル導入の抑制効果についての比較検討を行う．
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| 次年度の研究費の使用計画 |
遺伝子合成に関して，申請時より廉価に作成する事が可能となった．また，動物実験において使用する研究試薬や導入遺伝子の濃度を低値にできるように，遺伝子導入条件を改良する事ができたので，実験試薬，遺伝子合成費用，実験動物の個体数を押さえることができた．
再現性の追求のために，多くの再現実験が必要であるので，１回の実験経費が低額となったが，今後の多くの再現実験に使用していく．
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