| 研究課題/領域番号 |
24390451
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
星 和人 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (30344451)
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| 研究分担者 |
高戸 毅 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (90171454)
森 良之 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (70251296)
藤原 夕子 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (50466744)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 間葉系幹細胞 / 造血幹細胞 / 骨 / 増殖 / 分化 |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、造血幹細胞によって誘導されるMSCのステムネス-シグナルを解明し、シグナル関連分子を活用して高ステムネスを維持するMSC増殖培養法を確立することである。
当該年度研究実績は、以下の如くである。
1)間葉・血球共培養の確立を目的として、間葉系の細胞にはマウス由来間葉系幹細胞(MSC)を用いた。MSC単離は、マウス大腿・脛骨より採取し、血球系細胞にはヒト白血病急性骨髄芽球細胞株(KG-1)を用いた。これらの細胞を直接または間接的に共培養を行い、培養後、MSC、KG-1をそれぞれ回収、セルカウントを行い、共培養によるMSC増殖変化を検討したところ、直接・間接共培養の両培養系でMSCの増殖促進を認めた。増殖した細胞がマウス由来であることを証明するために種特異的DNAプローブを用いてFISH解析を行い、上記結果を反映していることが確認された。また、共培養によって増殖したMSCのステムネスを評価するために、MSCを幹細胞マーカーで標識しEACSを用いて解析したところ、ステムネスが有意に維持されていた。これまでの結果により、血球から間葉へのステムネス・シグナルの存在が示唆された。
2>マウス骨折治癒モデルを用いた間葉ステムネス・シグナルの検証として、造血幹細胞の形成が著しく抑制されているc-Mp1遺伝子欠損マウスをin vivoでのloss of functionモデルとして活用した。まず、野生型マウス骨折治癒モデルを作製し、モデル作製後1、2、4週で骨折部治癒経過を単純X線撮影、組織像などを用いて評価し軟骨や骨の形成を解析した。その他、免疫染色によりMSC様細胞の局在を同定するとともに、細胞増殖を形態計測学的に評価した。さらに、c-Mp1遺伝子欠損マウスを繁殖させ、同様のモデルを作製した。現在、野生型マウスとc-Mp1遺伝子欠損マウスの骨折治癒過程や、MSC増殖、軟骨や骨への分化誘導を詳細に比較検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
共培養系の検討においては当該年度中に造血系から間葉系へのステムネス・シグナルの存在を示唆し得たため、計画は順調に進捗している。また、マウス骨折治癒モデルにおいては、野生型マウスではすでに評価完了となっており、またc-Mplノックアウトマウスにおいても、現在詳細な解析がほぼ完了しているため、研究は概ね順調に進展していると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
ステムネス・シグナル関連分子の検索として、マウスMSCとKG-1細胞の共培養系を用いて、シグナル遺伝子をマイクロアレーにより網羅的に解析し血球系から間葉系へのステムネス・シグナル候補を選定するとともにステムネス・シグナル関連分子の間葉系における機能解析を行い、MSCの細胞増殖評価ならび多分化能評価を行い、MSCステムネスの変化を検証する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ステムネス・シグナル関連分子の検索については、GFP陽性マウスMSCとcaspase8導入KG-1細胞の共培養系を用いて、シグナル遺伝子を解析する。培養後、mR州を回収し、マイクロアレーにより網羅的に解析する。また、変動遺伝子のうち、著明な発現上昇を示す上位遺伝子を30程度検討する。候補遺伝子の発現上昇に対する再現性は、同共培養系を用いてGFP陽性マウスMSCにおける発現変化をreal time RT-PCRを用いて検討し、血球系から間葉系へのステムネス・シグナル候補を選定する。さらに上記候補分子について、マウス骨折モデルを用いてin vivoでの発現変動を評価する。
ステムネス・シグナル関連分子の間葉系における機能解析については、関心分子について、抑制型あるいは恒常活性型遺伝子をクローニングし、MSCに感染導入する。共培養系を用いて、関心遺伝子の抑制型を導入したMSCとKG-1の共培養を行った後MSCを回収し、MSCステムネスの変化を検証する。関心分子の機能を抑制する中和抗体およびインヒビターも使用する。また、恒常活性型遺伝子を導入したMSCについては、遺伝子導入後、細胞増殖評価ならび多分化能評価を行い、導入した遺伝子がMSC分化に促進的に働くことを確認し、シグナル分子の機能を解析する。マウス骨折モデルにおいてもlentivirusによる遺伝子導入を行い、上記シグナルの機能を検証する。抑制型あるいは恒常活性型遺伝子を担持したlentivirusを野生型、c-MPL遺伝子欠損マウス骨折部に注入し、骨折治癒をX線所見、μCT所見、組織像で評価しempty vesctorと比較する。
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