| 研究課題/領域番号 |
24500387
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| 研究機関 | 埼玉医科大学 |
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研究代表者 |
中尾 啓子 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (70338185)
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| 研究分担者 |
伊丹 千晶 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (90392430) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | Notchシグナル / 神経活動依存的シグナル伝達 / 子宮内電気穿孔法 / 大脳皮質体性感覚野 / c-Fos / バレル形成 |
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| 研究実績の概要 |
出生児の未成熟な脳は、環境からの情報入力を受ける際の神経活動依存的にネットワークが成熟する『臨界期』と呼ばれる時期を経て、成人型の脳へと発達を遂げるが、そうした神経活動依存的に活性化されて神経細胞の成熟を促すシグナル伝達系の存在が近年次第に赤ら化になってきている。これまで明らかになっているそうしたシグナル伝達系は、胚発生初期には、神経幹細胞・神経前駆細胞の未分化性の維持や、増殖・分化などに関与することから、我々は、体性感覚野の発達期に見られる神経回路形成をモデルとして、胚発生期に神経幹細胞の未分化性の維持や、増殖分化の制御に関わっていることが知られているNotchシグナル伝達系が神経細胞の活動依存的な機能分化に関わるメカニズムを明らかにすることを目的として研究を行っている。
我々がかつてNotchシグナル伝達系の活性をマウス個体内でモニターできるRBP-J依存的なNotchシグナルの細胞内伝達系のレポーター遺伝子を開発したが(Kohyama et al Dev. Biol.2005 特許第4599610号(平成22年10月8日)、このレポーター遺伝子を子宮内電気穿孔法によりE14.5日マウスの脳に導入したところ、バレル形成期の第IV層に存在する興奮精神系細胞において一過性にNotchシグナルの活性が認められ、それは RBPJのSH RNA型ベクター を同時に導入したRBPJのノックダウン細胞では認められなかったことからRBPJ依存的であることもわかった。また、Notchシグナルの活性化が一過性に認められる細胞では神経細胞の活性化の指標であるc-Fosの発現とも完全に一致した。さらに、Notch SH RNA型ベクターを導入するとバレル形成が阻害されたことから、Notchシグナルはこの時期のバレル形成に必須である事が明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
当初の予定では、Notchシグナルの体性感覚野における活性の検出、及び、体性感覚野へのひげからの感覚入力依存性を解析するために、体性感覚野におけるNotchシグナルの活性化をモニターするレポータートランスジェニックマウスをMizutani et al Nature 2007 に発表されている系統をJacksonラボから購入できる予定であったが、このマウス継代を重ねてNotch シグナル伝達系の活性の指標である蛍光タンパク質を発現しなくなってしまっていることを知り、国立遺伝研の相賀由美子先生よりご提供のお申し出を頂いたが、そのマウスが理研BSIからavailableになるまでにライセンス等の手続きの関係でさらに時間が掛かってしまったので、間もなく入手できることになったため、実験の1/3くらいが未だ実施できていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
相賀由美子先生が作成されたNotchシグナルのレポーターを発現するトランスジェニックマウスが搬入され次第予定していた実験を再開する。
特にこれまでは、Notchシグナルのレポーター遺伝子とNotch遺伝子のノックダウンベクターを細胞に同時に導入することしかできず、Notchシグナルの活性のモニターをNotchシグナルのリガンド分子のノックダウンを独立に行うことが困難であった。
しかし、このトランスジェニックマウスを使えば、Notchシグナルのレポーター遺伝子を常時モニターできる状況下で、Notchシグナルのリガンドや修飾因子がバレル形成にどのように関与しているかを継時的に解析することが出来る。
又、当初予定していなかったが、Notchシグナルのレポーターや、ノックダウンベクターを導入した脳の連続切片を作成したところ、体性感覚野以外に、大脳皮質の様々な領域(例えば視床下部）で一過性に活性化され、又そうした領域でもNotchシグナルが神経細胞のネットワーク形成に関与していることが明らかになってきた。そこで、バレルに限らず、大脳皮質の神経細胞の活性依存的な分化・成熟へのNotchシグナルの関与についても明らかにしたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初Jaxon Labから購入予定であった本研究課題の中心であるNotchシグナルのレポーターマウスが、継代を重ねているうちに使用不能になっていることが、Notch シグナルの国際シンポジウムに参加してわかり、他の入手先として国立遺伝研相賀由美子博士の作成中だったマウスを使わせていただけることを御承諾いただいていたのだが、実際に、作成され、それがオープンリソースである理研BSI経由で入手する事が可能になるまでに結果的に2年以上待つことになったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
理研BSIからNotchレポーターを発現するトランスジェニックを入手次第、研究助手の雇用を継続しすると共に、この課題のための雇用時間を増やす。さらにマウスが入手できずに延期していた実験を行うために抗体等の購入、マウスの飼育費などの支出が見込まれる。
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