| 研究課題/領域番号 |
24500393
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
|---|
研究代表者 |
戸島 拓郎 独立行政法人理化学研究所, 神経成長機構研究チーム, 研究員 (00373332)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
|
| キーワード | 軸索ガイダンス / 成長円錐 / カルシウム / エンドサイトーシス / クラスリン |
|---|
| 研究概要 |
神経回路形成過程の神経軸索先端部に現れる成長円錐は、細胞外環境に呈示される多彩な軸索ガイダンス因子の濃度勾配に応じて自身の運動性を変化させ、軸索を正しい標的まで牽引する。研究代表者はこれまでに軸索ガイダンスの分子機構を解析し、Ca2+シグナルにより誘起される成長円錐片側でのエクソサイトーシスとエンドサイトーシスのバランスによって軸索の旋回方向（誘引／反発）が決定されることを解明してきた。また、Ca2+下流においてエンドサイトーシスの促進と抑制を担う分子としてそれぞれカルシニューリンとCdk5を同定した。本課題では、カルシニューリンとCdk5により拮抗的リン酸化制御を受けるエンドサイトーシス調節因子を同定することを目的としている。第一候補として、dephosphinと総称されるクラスリンアダプタータンパク質群の一員であるホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼgamma（PIPKIg）に着目している。しかしながら、研究代表者が実験試料として用いているニワトリのPIPKIはこれまでクローニングされていなかった。そこで本年度は、まずニワトリPIPKIgのクローニングを行った。その結果、C末端領域にクラスリンアダプタータンパク質AP2との結合領域を持つバリアントと持たないバリアントの2種類が存在することを確認し（それぞれPIPKIg90およびPIPKIg87）、その全長配列を決定した。続いて、成長円錐の反発性旋回運動におけるPIPKIg90－AP2間結合の必要性を検証するために、ニワトリPIPKIg90のAP2結合領域配列のペプチド断片を合成し、これが成長円錐の旋回運動に及ぼす影響について解析した。その結果、この合成ペプチドはケージドCa2+による誘引性旋回運動には効果が無く、その一方で反発性旋回運動を消失させることが明らかになった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ニワトリPIPKIg90およびPIPKIg87のクローニングが成功するなど、研究は順調に進捗し、おおむね申請書に記載した予想通りの達成度である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後も基本的には研究計画書どおりに研究を遂行して行く予定である。具体的には、平成２５年度は、ニワトリPIPKIg90のキナーゼ活性欠損変異体を作成し、ケージドCa2+光解離法により誘発される成長円錐の誘引性・反発性旋回運動に対するニワトリPIPKIg90キナーゼ活性の必要性を検証する。続いて、PIP2可視化プローブである蛍光タンパク質標識PLCd-PHを生きた成長円錐に発現させた上で全反射蛍光顕微鏡法により観察し、形質膜直下におけるPIP2合成の時空間動態を可視化する。成長円錐の旋回運動を引き起こすCa2+シグナルに応じて、ニワトリPIPKIg90依存的なPIP2量の変動が実際に起こるかどうかを検証する。またこの現象に対するCdk5／カルシニューリン依存性も薬理的に確認する。さらに、蛍光タンパク質標識クラスリンを発現させた成長円錐を全反射蛍光顕微鏡法で観察し、形質膜上に存在するクラスリン被覆ピットの動態を追跡することでクラスリン依存性エンドサイトーシスの時空間動態を単一小胞レベルで可視化する。その上で、形質膜上のPIP2とクラスリン被覆ピットを二色同時観察し、両者の時空間動態の関連性を解析する。具体的には、反発性Ca2+シグナルに応じてまず先にPIP2が合成された後、その後に同じ領域においてクラスリン被覆ピットが形成されるという現象が観察されることが予想される。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
該当なし
|
