| 研究概要 |
筋萎縮性側索硬化症(ALS)関連遺伝子TDP-43, FUS cDNAや蛋白分解系を阻害するshRNAを発現する組換えアデノウイルスをラット運動ニューロンに混合感染導入することにより，運動ニューロンに細胞内凝集体を形成させることができる．本年度は，これらcDNAやshRNAを発現する各種組換えウイルスベクターを作製し，成体ラット・マウス顔面神経核運動ニューロンへの遺伝子導入法を比較検討した．ヒト正常および変異TDP-43またはC末断片 (208-414) TDP-43，正常および変異FUSを発現する組換えアデノウイルスおよびレンチウイルス，プロテアソーム，エンドソーム，オートファジーに対するshRNAを発現する組換えアデノウイルスおよびレンチウイルス，またはGFP発現2, 6, 9型アデノ随伴ウイルス(AAV2, 6, 9)を成体ラット・マウスの顔面神経，あるいは定位脳手術下に脳幹顔面神経核に単独または混合して注入接種した．組換えアデノウイルスでは顔面神経からの逆行輸送により注入後３日で顔面神経核運動ニューロンに導入遺伝子の強い発現を認め，その導入効率はラットよりもマウスの方が高く，TDP-43, FUSと蛋白分解系を阻害するshRNA組換えウイルスの共感染により凝集体の形成を認めた．一方，組換えレンチウイルスを定位脳手術下に脳幹顔面神経核に注入接種したところ，運動ニューロンおよびグリア細胞にTDP-43遺伝子が導入できた．さらに，AAV2, 6, 9-GFPを顔面神経に注入接種すると，AAV6, 9-GFPがマウス顔面神経から効率よく逆行輸送され顔面神経核運動ニューロンに遺伝子導入されることがわかった．以上より，運動ニューロンにおけるTDP-43, FUSの凝集体形成は各種ウイルスベクターにより効率よく誘導しうると考えられた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１．組換えアデノウイルス，組換えレンチウイルスの作製：①ALS関連遺伝子のクローニング：ヒト正常および変異TDP-43またはC末断片TDP-43，正常および変異FUS, VCP, UBQLN2をDsRed発現ベクターにクローニングした．②shRNA発現ベクターの作製：以下の遺伝子の発現を阻止しうるラットshRNA配列をpGneneClip-hMGFP (Clontech)にクローニングした；PSMC1, TSG101, VPS24, CHMP2B, Atg5, Atg7, TDP-43, FUS, VCP, UBQLN2 ADAR2．③組換えウイルスの作製：上記①②のcDNA/DsRed断片，shRNA/GFP断片を発現する組換えアデノウイルス，レンチウイルスを作製，大量培養ののち精製ウイルスを得た．
２．培養運動ニューロンにおける凝集体形成：培養ラット胎仔初代腰髄運動ニューロン，またはマウスES細胞から分化させた運動ニューロンに，上記組換えアデノウイルス，レンチウイルスを感染させた．また成体ラット神経幹細胞から分化させたニューロン・グリア（アストロサイト，オリゴデンドロサイト）にも感染を試みた．TDP-43, FUS, VCP, UBQLN2発現ウイルスと各shRNAウイルスの共感染によりニューロン，グリア細胞内凝集体の形成過程を解析した．
３．成体ラット運動ニューロンにおける凝集体形成：成体ラットの右顔面神経に上記組換えアデノウイルスを単独または複数の組み合わせにより注入接種し，組換えウイルスの逆行輸送による運動ニューロンにおける導入遺伝子の発現を確認し，凝集体の形成を検討した．一方，定位脳固定装置を用いてラットの脳幹部顔面神経核に上記組換えレンチウイルスを注入接種し，ニューロンおよびグリア細胞に長期感染発現させ同様に解析した．
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| 今後の研究の推進方策 |
１．培養運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明：前年度に引き続き，初代運動ニューロン，ES細胞分化運動ニューロン，神経幹細胞分化ニューロン・グリア細胞培養系に組換えアデノウイルス，レンチウイルスを感染させ，凝集体の形成過程を経時的に蛍光抗体法，免疫電顕により解析する．また，細胞死をannexin-V, propidium iodide, TUNEL染色，細胞数計測にて解析する．
２．成体ラット運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明：前年度に引き続き解析をすすめるとともに，PALM－MBIII レーザーマイクロダイセクションシステムを用いて凍結組織切片から蛍光陽性の凝集体を持つ運動ニューロンを切り出して回収し，RNAを調整，リアルタイムRT-PCRにより凝集体形成と遺伝子発現の関連を解析する．また研究の進展によってはマイクロアレイ解析も考慮する．以上により，初年度の結果とあわせて，TDP-43, FUS, VCP, UBQLN2とプロテオソーム・エンドソーム・オートファジーのどの遺伝子を過剰発現あるいはノックアウトすると凝集体が形成されうるか，細胞死の鍵を握る分子は何か，蛋白分解系，凝集体形成と細胞死にはどのようにリンクがあるのか，グリア細胞の関与は必要か否か，を解明する．
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