| 研究実績の概要 |
我々はこれまで，TDP-43, FUS cDNAや蛋白分解系を阻害するshRNAを発現する組換えアデノウイルスをラット，マウス末梢神経に混合接種すると，ウイルスの軸索内逆行輸送により運動ニューロンに細胞質内凝集体を形成しうることを報告した．しかし組換えアデノウイルスによる外来遺伝子発現は接種後1週間をピークに急速に減衰していく．そこで，より長期間安定した遺伝子導入発現が期待できる組換えアデノ随伴ウイルス9型(AAV9)または組換えレンチウイルス(LxFuGB2)に関して検討した．ヒト正常またはC末断片 (208-414) TDP-43，正常または変異(P525L) FUSをDsRedとともに発現する組換えAAV9およびLxFuGB2，プロテアソーム(PSMC1)，オートファジー(ATG5)に対するshRNAをEGFPとともに発現する組換えAAV9およびLxFuGB2を，８週齢ICRマウスの顔面神経または坐骨神経に注入接種したところ，軸索逆行輸送により注入後2~4週間で顔面神経核，腰髄前角運動ニューロンに限局してTDP-43, FUS, shRNA導入遺伝子の発現を認め，TDP-43またはFUS/DsRedとPSMC1, ATG5 shRNA/EGFP組換えAAV9の共感染により運動ニューロン細胞体に凝集体が形成された．当初は感染運動ニューロンに限局するこれら凝集体が伝播していくか否かを経時的に観察できると考えられた． 一方，培養ラット神経幹細胞由来ニューロンに，ヒト正常またはC末断片TDP-43をDsRedとともに発現する組換えアデノウイルスを共感染させ，プロテアソーム阻害剤MG-132を負荷すると，タイムラプス蛍光撮影で12時間後よりDsRed陽性凝集体が形成されはじめ，細胞質に徐々に充満し，やがて細胞膜の破綻とともに細胞死に至る像が多数観察された．現在，凝集体の細胞間伝播の可視化に関しても検討を行っている．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１．組換えアデノウイルス，組換えレンチウイルス，組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)の作製：①ALS関連遺伝子のクローニング：ヒト正常および変異TDP-43またはC末断片TDP-43，正常および変異FUS, VCP, UBQLN2をDsRed発現ベクターにクローニングした．②shRNA発現ベクターの作製：以下の遺伝子の発現を阻止しうるラットshRNA配列をpGneneClip-hMGFP (Clontech)にクローニングした；PSMC1, TSG101, VPS24, CHMP2B, Atg5, Atg7, TDP-43, FUS, VCP, UBQLN2 ADAR2．③組換えウイルスの作製：上記①②のcDNA/DsRed断片，shRNA/GFP断片を発現する組換えアデノウイルス，レンチウイルス，AAV9を作製，大量培養ののち精製ウイルスを得た．
２．培養運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明：培養ラット胎仔初代腰髄運動ニューロン，またはマウスES細胞から分化させた運動ニューロンに，上記組換えアデノウイルス，レンチウイルス，AAV9を感染させた．また成体ラット神経幹細胞から分化させたニューロン・グリア（アストロサイト，オリゴデンドロサイト）にも感染を試みた．TDP-43, FUS発現ウイルスと各shRNAウイルスの共感染によりニューロン，グリア細胞内凝集体の形成過程を解析した．またタイムラプス蛍光撮影により凝集体形成に伴う細胞死を経時的に観察しえた．
３．成体マウス・ラット運動ニューロンにおける凝集体形成と細胞死の解明：成体マウス・ラットの顔面神経，坐骨神経に上記組換えウイルスを単独または複数の組み合わせにより注入接種し，組換えウイルスの逆行輸送による運動ニューロンにおける導入遺伝子の発現を確認し，細胞質凝集体の形成に成功した．
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