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アデノウイルス注入法により小脳プルキンエ細胞特異的にCa2+感受性蛍光タンパク質を発現させ、生きたマウスの小脳から二光子励起レーザー顕微鏡によってニューロン活動をリアルタイムで計測することで、特定の情報処理に関与するプルキンエ細胞群の網羅的同定というアプローチが可能となる。本研究では、小脳皮質上の機能単位の解明の為に、小脳皮質の唯一の出力細胞であるプルキンエ細胞に1波長励起2波長蛍光型Ca2+感受性蛍光タンパク質yellow cameleon2.60 (YC2.60)を発現させ、マウスの小脳から二光子励起レーザー顕微鏡による光学計測によりプルキンエ細胞の個々のスパイク発火を検出する実験手法およびデータ解析方法の確立を行った。生きたマウスの脳から蛍光画像を取得する際には、麻酔条件下であっても心拍や呼吸等による脳自身の振動に由来するノイズにより、本来取得すべき神経細胞の活動電位発生に伴う蛍光シグナルが大きく歪められる。この問題点を解決するために、取得画像に含まれるノイズ成分を解析し、新たなレシオ画像作成方法を考案した。2つの異なる波長の蛍光画像の比を取ることで細胞内Ca2+濃度を測定出来るというYC2.60の利点を生かし、２つの蛍光画像に含まれるノイズ成分が比を取ったときにキャンセルされるようにスケーリング処理を施した。このような前処理を行った画像をもとに、単一発火に伴う細胞内Ca2+濃度変化ダイナミクスを推定し、逆畳み込み演算により光学的に取得したCa2+シグナルから複雑スパイク発火を90%以上の確率で検出可能な解析方法を確立した。
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