| 研究課題/領域番号 |
24500786
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
人見 嘉哲 金沢大学, 医学系, 准教授 (70231545)
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| 研究分担者 |
神林 康弘 金沢大学, 医学系, 講師 (20345630)
中村 裕之 金沢大学, 医学系, 教授 (30231476)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 骨格筋 / 急性運動 |
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| 研究概要 |
高輝度蛍光タンパクをレポーターとする運動レポーター動物の作出を目指し、高輝度蛍光タンパクとレポーター発現を制御するプロモーター選択について検討した。これは、研究申請段階よりも遺伝子発現制御について網羅的解析情報が蓄積、公開されるようになり、計画していたCa2+依存性脱リン酸化酵素の制御因子RCN1（Regulator of calcineurin 1）プロモーター配列の妥当性、及び、運動レポーター動物作出に最適なプロモーター遺伝子の組み合わせをデータベース上で予測することが可能となったためである。
その結果、運動負荷前後の骨格筋において非常に多くの遺伝子発現変化がデータベース上に報告されていた。運動負荷の量と負荷後の時間と遺伝子発現量の関係、発現制御パスウエイについて検討をおこなったところ、多くの網羅的研究では、運動前後の変化量は詳しい一方で急性運動負荷前後での時間変化は予測が難しいことが分かった。また、遺伝子発現制御機構が不明の遺伝子が多く、大半が運動レポーター動物作出に用いるプロモーター配列候補にならないことが明らかとなった。
現在、運動負荷前後で短時間に数倍以上の発現誘導が報告されていること、ある程度、発現制御機構が予測できることを基準として、運動レポーターのプロモーター配列候補を選択し、PCR法によってマウス、及び、ヒト配列を増幅、レポーター遺伝子上流にクローニングを行い、培養細胞系にてプロモーター配列による発現制御を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
可視的に骨格筋活動を観察できる運動レポーター動物の作出に向けて、より確実性の高いレポータータンパクと発言制御プロモーター配列の選択を進めている。In vivo で時間分解能に優れたレポータータンパク発現を得るためには、現時点で入手可能な遺伝子発現解析情報を検索、検討する必要があり、遺伝子改変動物の作出スケジュールを大幅に遅らせることとなった。しかし、目的の運動レポーター動物の作出には、必須の作業であると考える。より質の高い動物を作出することは、レポーター動物を用いる研究を時間的に容易にすることが予想でる。従って、研究全体の進捗に大きな遅れになっていないと判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は、運動レポーター動物を作出して、可視的に骨格筋活動を観察することを目的にしている。研究立案時は、これまで研究してきたCa2+依存性脱リン酸化酵素の制御因子RCN1（Regulator of calcineurin 1）プロモーター配列をレポーター遺伝子の発現制御プロモーターに用いる予定であった。レポーター遺伝子の発現制御には、急性の骨格筋活動により一過性に強く誘導されること、遺伝子発現制御機構が明らかなことが必要な要件である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本研究の予算範囲で作出可能な遺伝子改変動物系統数は最大２系統であり、より確実性の高いレポータータンパクと発現制御プロモーター配列の選択は非常に重要である。そこで、公開されている網羅的遺伝子発現解析情報を用いて、当初の研究計画に無かったRCN1プロモーター配列の妥当性評価と同プロモーター配列以外の候補プロモーター配列の検索を実施してきた。平成24年度中に運動レポーター遺伝子の作成と遺伝子導入を実施できなかったため、研究費の大半を占める動物作出に係る費用を平成25年度に持ち越した。
平成25年度は、遺伝子改変動物（TG動物）の作出とTG動物系統の樹立を目標とする。In silicoで選択したプロモーター配列候補を組み込んだレポーター遺伝子を培養細胞系を用いて動作確認を行う。確認されたレポーター遺伝子を一過性にマウス骨格筋に導入し、骨格筋活動によるレポータータンパクの発現誘導と発現量の時間的推移を観察し、動物作出により適した運動レポーター遺伝子を選択する。
選択したレポーター遺伝子を用いてTG動物の作出を専門の受託業者に依頼する。系統はマウスB6とし、受精卵への遺伝子導入から離乳までを業者に委託する。TG動物作出に用いるDNA調製、導入遺伝子の検出、ファウンダー動物からの系統樹立等は、所属の研究室で行いTG動物作出に係る費用を抑える。
得られたファウンダー動物を野生型B6と交配し、TG動物系統を樹立する。可能であれば年度内にF1、ないし、F2世代を用いてレポータータンパク発現を検索する。
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