| 研究課題/領域番号 |
24501331
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 島根大学 |
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研究代表者 |
原田 守 島根大学, 医学部, 教授 (50260716)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 癌 / アポトーシス / オートファジー |
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| 研究概要 |
初年度は、ヒト乳癌、ヒト膵臓癌の細胞株を用いて、癌細胞特異的にdeathシグナルを介してアポトーシスを誘導するTRAIL、アジュバント受容体リガンドのtransfectにより誘導される癌細胞のアポトーシスとオートファジーの（相互制御の）関係を明らかにすることに取り組んだ。１）ヒト癌細胞でのオートファジーの発現の検証：種々のヒト癌細胞株でオートファジーが構成的、又は、誘導性に生じているかをLC3 type IIの発現をimmunoblot法で、GFP-LC3 遺伝子を発現させた癌細胞ではGFP-LC3 fociの形成を共焦点顕微鏡で検証し、オートファジーが生じていることを確認し、その評価系を確立した。さらに、一部の癌細胞株では、GFP-LC3 遺伝子を恒常的に発現させたstable transfectsを確立した。２）TRAILが誘導するアポトーシスとオートファジー：Death receptor を介するシグナルで癌細胞にアポトーシスを誘導するTRAILが、癌細胞にアポトーシスを誘導する場合に、オートファジーを誘導・増強または抑制することによりアポトーシスの程度が影響受けるかを、オートファジーに必須の分子であるBeclin-1やATG5を knock downすることにより検証し、確かにオートファジーがアポトーシスに対して防御的に作用していることを明らかにした。３）TLRリガンド刺激による癌細胞でのアポトーシスとオートファジーの検証：poly(I:C) transfectionで誘導されるアポトーシスでのオートファジーの役割を検証し、この実験系においてもオートファジーが防御的に作用していることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度は、ヒト乳癌、膵臓癌の細胞株や手術切除した癌組織細胞を用いて、癌反応性キラーＴ細胞、TRAIL、アジュバント受容体リガンドのtransfectionにより誘導される癌細胞のアポトーシスとオートファジーの（相互制御の）関係を明らかにすることを目的としたが、実験に使用する癌反応性キラーＴ細胞の準備は困難であった。しかし、再現性をもって実験に使用するには癌反応性キラーＴ細胞と同様に癌細胞死を誘導するTRAILが有用であった。その後、TRAILを用いて、癌細胞のアポトーシスを検証し、オートファジーの役割を検討したが、予想通り、オートファジーは細胞防御的に作用していることを明らかにできた。一方、申請者らがすでに報告した、TLR3リガンドであるpoly(I:C)を癌細胞の細胞質内transfectし、細胞死を誘導する実験系においても、予想通り、オートファジーが防御的に働いていることを明らかにできた。これらの研究成果もすでに論文として報告したことから、初年度の研究目的はおおむね達成できたのではと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度は、ヒト乳癌、膵臓癌の細胞株を用いて、TRAIL、アジュバント受容体リガンドのtransfectionにより誘導される癌細胞のアポトーシスとオートファジーの（相互制御の）関係を明らかにすることに取り組み、大部分は達成したので、今後の研究は、ヒト癌細胞をTRAILまたは抗体とＮＫ細胞を用いたADCC治療した場合に、癌幹細胞が選択的に残存するか、もしそうであれば、その過程にオートファジーが関与しているかを膵癌と乳癌細胞を用いて取り組む。さらに、オートファジー抑制による癌免疫療法の治療効果の増強をxenograft model を用いてin vivo の実験系で検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成24年度は未使用額(4,111円）が生じた。この未使用額(4,111円）も含めて次年度は、オートファジーと癌幹細胞の関連性を明らかにする予定である。そこで、ヒト癌細胞をTRAILで処理してアポトーシスを誘導した時に、残存した癌細胞中の癌幹細胞の比率をCD133、CD24、CD44をマーカーとして検討する。乳癌の場合は、herceptinとNK細胞によるADCCの系を用いる。これを実施するために、種々の抗体を購入する必要がある。また、癌細胞のオートファジー関連遺伝子(Beclin1, ATG5 etc.)をsiRNAでknock downして検証するために、これらのsiRNAやtransfection reagentを購入する。さらに、オートファジー誘導剤であるrapamycinやオートファジー阻害剤である3-methyladenineを購入する。また、xenograft mouse model を用いて in vivo で検討するので、免疫不全マウスを購入する。以上、大部分が、消耗品の購入に充てる予定である。
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