研究課題
基盤研究(C)
放射線適応応答では、細胞の生存率の他に染色体異常や突然変異頻度が低下することから、DNA２本鎖切断修復の正確度が上昇しているものと考えられ、特に非相同末端結合修復（NHEJ）が関与していると推定される。NHEJには「古典的経路」と「代替経路」の２種類の経路があるとされているため、放射線適応応答の過程にどちらの経路が関与するかを検討した。「古典的経路」にはDNA切断の連結酵素の１種であるDNAリガーゼ IVが関与していることが知られている。一方、「代替経路」の分子機構は未だ明らかではないが、DNAリガーゼ IIIが関与しているものとこれまでに推定されている。そこで、これら２つのDNAリガーゼの量を低下させた細胞を作成し、その細胞における放射線適応応答を分析した。細胞内のDNAリガーゼ量を低下させるには、RNA干渉法を用いた。まず、両方のDNAリガーゼとも、それぞれ３種類の干渉用RNAを用いてRNA干渉を行い、最もDNAリガーゼ量を低下させることができる干渉用RNAを検索した。DNAリガーゼ量を分析するために、ウェスタンブロット法を用いたが、DNAリガーゼの発現量が低いためか、種々の条件検討を行ったが極めて薄いバンドしか検出できず、DNAリガーゼ量が低下しているかを明確にすることが非常に困難であった。そのため、ウェスタンブロット法以外に、伝令RNAを増幅するRT-PCR法を用いることにより検出することを試みているところである。一方、放射線適応応答に関して、DNAリガーゼ干渉用RNAを導入した細胞を用いて、Ｘ線照射後の生存率を指標として検討したところ、DNAリガーゼIVの干渉用RNA３種類のうちの１種類を導入した細胞で適応応答が抑制されたことを示唆する結果が得られた。従って、DNAリガーゼIVが関与している可能性が考えられるが、今後さらに確認する必要がある。
2: おおむね順調に進展している
DNAリガーゼIIIとDNAリガーゼIVについてそれぞれ３種類の干渉用RNAを導入したところ、１種類のDNAリガーゼIV干渉用RNAを導入した細胞で放射線適応応答が抑制されたことを示唆する結果が得られた。また、DNAリガーゼIII干渉RNAを導入した細胞では、いずれも放射線適応応答に関与することを示唆する結果が得られなかった。従って、放射線適応応答にはDNAリガーゼIIIの関与は少なく、DNAリガーゼIVが関与している可能性が示唆された。このことは、これまで詳細な修復機構が明らかでなかった放射線適応応答の機構解明に大きな前進であると言える。本年度は生存率を指標として用いたが、今後はその他の指標についても検討して、さらに詳細な実験を重ねて上記の結果の確認を行うことが必要であるが、順調に進捗していると言える。しかし、DNAリガーゼ量の検出が予想以上に困難であったため、検出の条件決定に非常に時間を要した。そのため、干渉用RNAを導入した細胞において、実際にどの程度DNAリガーゼ量が低下しているかが現在に至っても明確でなく、当初計画よりもやや遅れている。これについては検出方法をタンパク質を検出するウェスタンブロット法から、伝令RNAを検出するRT-PCR法に変更することとし、条件検討しているところであり、間もなく解決できるものと考えている。全体としては、大きな遅れはなく、おおむね順調に進捗していると考えている。
まず、RNA干渉法によるDNAリガーゼ量の低下を確認することがまず必要である。これについては既にRT-PCR法を用いた検出を行うこととして、条件検討を行っているところである。早急に条件を確定して、DNAリガーゼの発現量を検討する。DNAリガーゼIVが放射線適応応答に関与することを示唆する結果が得られたが、この結果の確認を行う必要がある。また、DNAリガーゼIII干渉RNAを導入した細胞では、いずれも放射線適応応答に関与することを示唆する結果が得られなかったが、この点についてもさらに確認する。一方、従来NHEJの「代替経路」にはDNAリガーゼIIIが関与するとされてきたが、近年DNAリガーゼIIIではなく、DNAリガーゼIであることを示す結果が報告されている。従って、これまで検討してきたDNAリガーゼIIIとDNAリガーゼIVだけでなく、DNAリガーゼIについても、放射線適応応答に関与するかについて検討する必要がある。特に、本年度の研究によりDNAリガーゼIIIが放射線適応応答に関与しないことを示唆する結果が得られたが、これはDNAリガーゼIIIではなくDNAリガーゼIが「代替経路」に関与していることによるものである可能性があり、この点について早急に検討する必要がある。また、放射線適応応答の検出方法も、本年度は細胞の生存率を指標として用いたが、今後は、染色体異常やプラスミドDNAの２本鎖切断再結合反応なども指標として、放射線適応応答を検討する予定であり、そのための準備を進めているところである。
次年度にはこれまでのDNAリガーゼIIIとIVだけでなく、DNAリガーゼIについても解析を行うことにしている。また、放射線適応応答の検出方法として、染色体分析やプラスミドDNAの２本鎖切断再結合反応も実施して、適応応答の詳細な解析を行う予定である。さらに、RNA干渉の効率を検討するためにこれまでのウェスタンブロット法に加えてRT-PCR法も行う。これらの実験実施のための消耗品の購入に研究費の大部分を使用する計画である。
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Journal of Radiation Research
巻: 53 ページ: 58-71
10.1269/jrr.11034
