| 研究課題/領域番号 |
24510072
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
田野 恵三 京都大学, 原子炉実験所, 准教授 (00183468)
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| 研究分担者 |
増永 慎一郎 京都大学, 原子炉実験所, 教授 (80238914)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 国際情報交換、米国 |
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| 研究概要 |
脊椎動物細胞に存在する活性酸素種（ROS）は、放射線や環境変異原が原因で生じるだけでなく、通常の生理作用でも絶えず生じている。このような細胞内因性ROSは、抗酸化酵素や蛋白の働きで生理学的に至適な活性酸素環境に維持され、細胞の健全な生理機能に寄与する。
本申請期間における研究は、これら至適環境維持を担う抗酸化酵素や蛋白に着目し、その遺伝子を欠損させた細胞を作製することで結果的に内因性ROS を増加させ、その解析結果から、内因性ROSの生物影響評価とその至適環境維持機構について、生物学的意味を明らかにすることを目的としている。
２４年度は主に、既に作成したSOD1とSOD2の条件欠損細胞を用いた抗酸化剤の機能解析を行った。その結果、既に成果を発表したアスコルビン酸以外で、尿酸がSOD1枯渇による細胞内酸化度の増加に伴う娘染色体交差の頻度を有意に減少させることを見いだした。さらに、PRDX 条件欠損細胞を用いて条件変異型のPRDX1変異蛋白の発現細胞のためのベクターの構築を行い、これら変異型蛋白をTet-Off型で発現する細胞のスクリーニングを行なった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SOD1条件欠損細胞を用いた、SOD1枯渇による致死作用や染色体損傷の解析は、順調に進んでいる。既存の抗酸化剤多くは、SOD1あるいはSOD2枯渇による細胞致死や増殖疎外、その他の表現型を抑制できるものが無かったが、そのうち唯一、尿酸が娘染色体交差を抑制でき、我々の条件欠損細胞システムにおいて有用性を示すことができた。
また、当初の研究計画通り、ミトコンドリアに局在するSOD2蛋白の脱アセチル化酵素であるSirt3と同様に、ミトコンドリア局在型のSirt6のノックアウト細胞を得るなど、適格な表現型解析を順次始めつつある。現時点において、これら２つの条件欠損細胞が、通常培養における増殖速度がかなり低下することを確認している。
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| 今後の研究の推進方策 |
２４年度は、概ね順調に研究を進めることができたが、改善すべき点もあった。特に、内因性活性酸素レベルの増加に伴うDNA損傷マーカーとして、娘染色体交差だけを用いてきたが、致死や重篤の増殖阻害を引き起こすマーカーとしては、必ずしも最善の方法とは言えない。
そこで、２４年度末より、染色体断裂あるいは損傷修復に関与する蛋白の集積動態と免疫染色による解析方法を導入しつつある。さらに、アルカリコメット法による細胞集団レベルでのDNA単鎖切断の解析も試みている。２５年度はこれらの方法を用いて、従来のデータについて、さらに詳細な解析を進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究経費については、申請した項目に沿って支出する予定であり、大きな逸脱を生じることは無い。主に、培養に必要なプラスチック器具と培地関連の試薬、生化学実験に用いる解析キット等が消耗品の中心となる。また、研究成果の発表に伴う投稿論文の英文校正費と投稿料への支出を予定している。旅費は、結果成果発表と関連情報収集を目的とし、関連学会（日本放射線影響学会、環境変異学会、日本分子生物学会、酸化ストレス学会）に参加するための費用として支出を予定している。
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