| 研究課題/領域番号 |
24510077
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 独立行政法人放射線医学総合研究所 |
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研究代表者 |
小池 学 独立行政法人放射線医学総合研究所, 放射線防護研究センター, 主任研究員 (70280740)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | Ku80 |
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| 研究概要 |
低線量放射線の人体への影響の解明は喫緊の課題である。放射線により誘発されたDNA二本鎖切断(DSB)が非相同末端結合 (NHEJ) 機構で修復されると突然変異や発がんの原因になりうる。Ku(Ku70/Ku80)はNHEJ機構に不可欠な修復蛋白質である。これまでNHEJ機構のモデリングは主に齧歯類やニワトリの細胞を材料に行われてきたが、ヒトとこれら生物種では修復機構の選択等に相違がある。例えば、ヒト細胞ではこれら生物種には存在しないもう一つのKu80が発現してNHEJ機構の活性調節をしている可能性が報告されている。本研究では、放射線生物学と先端生命科学技術により２種類のKu80の機能を比較し、ヒトのDSB修復機構を含むDNA損傷応答機構の新たなモデルを提示することを目指す。 もう一つのKu80(KARP-1)とKu80の機能を比較解析するために、KARP-1遺伝子が無い齧歯類細胞を親株に、(1)「KARP-1発現Ku80欠損細胞株とKu80発現KARP-1欠損細胞株」を作出する。最近、私達はGFP標識ヒトKARP-1発現xrs6細胞株（KARP-1発現Ku80欠損細胞株）を樹立した。そこで、同様の方法により、KARP-1に特異的な領域（N末:88アミノ酸）を発現する細胞株を新たに樹立するために、遺伝子工学技法により、プロモーター(CMV)の下流にGFP融合KARP-1(1-88)遺伝子を連結した発現ベクターを構築した。次に、xrs6細胞に一過性に遺伝子導入を行い、細胞内の発現と局在を調べた。その結果、KARP-1(1-88)は、Ku80(KARP-1)と同様に細胞核に局在する事が明らかになった。現在、導入した細胞とその親株等を材料に、分子細胞生物学的な解析を進めている。加えて、KARP-1発現マウスを作製するために、KARP-1遺伝子発現プラスミドの作成を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
KARP-1導入細胞株の解析や特異抗体の作製、KARP-1発現マウス作製の準備はほぼ順調に進んでいる。一方、Ku80欠損細胞株を使用する実験に関しては、やや遅れが生じた。具体的には、予想外にもEGFPを発現させたKu80欠損細胞株の放射線感受性が、親株よりも高い事がわかったので、その原因究明とコントロールに使用する細胞株について放射線未照射時と照射時の実験の諸条件の再検討を行う必要が生じたために若干遅れが生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２５年度は、２４年度から進めているKu80欠損細胞株を材料とする実験を進める。さらに、年次計画にそってヒト細胞でのKARP-1の機能を解析するために、ヒト細胞を材料とする実験を開始する予定である。また、個体での解析を行うためのモデルマウスの作製を進める予定である。尚、内在性のKu80との競合を避けるために、Ku欠損マウスの使用も検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
計画に沿って、使用する予定である。尚、繰り越した分は平成２４年度に遅れを生じたKu80欠損細胞株を利用する実験を進めるために使用する予定である。
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