| 研究課題/領域番号 |
24510087
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
黒田 純子(木村純子) 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳発達・神経再生研究分野, 主席研究員 (20142151)
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| 研究分担者 |
川野 仁 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳発達・神経再生研究分野, 副参事研究員 (20161341)
小牟田 縁 公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳発達・神経再生研究分野, 研究員 (60566850)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 環境化学物質 / 脳・神経 / 脳発達 / 神経毒性 / シナプス形成 / 培養神経細胞 / 農薬ネオニコチノイド |
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| 研究概要 |
今年度は、研究実績のあるネオニコチノイド系農薬イミダクロプリド、アセタミプリドについて主に研究を進めた。ネオニコチノイドは昆虫選択毒性が高く、ヒトには安全性が高いと宣伝され使用量が急増しているが、一方で哺乳類やヒトへの影響が懸念されている。ネオニコチノイドはニコチンと似た構造を持ち、神経伝達物質アセチルコリンの受容体の一種、ニコチン性受容体にアゴニスト作用をもつ。ニコチン性受容体はヒトでは末梢神経だけでなく中枢神経でも重要で、さらに免疫系など非神経組織でも生理機能をもっている。また脳の発達過程でもニコチン性受容体は多量に発現して、正常な神経回路形成に関与していることも分かっている。
これまでに我々は、ラット小脳培養系を用いて、ネオニコチノイド系農薬の作用をニコチンと比較して調べたところ、ネオニコチノイド２種がニコチン同様に１μM以上で興奮性カルシウム流入を起こし、その反応が特異的アンタゴニストにより阻害されることを見出した。このネオニコチノイドの作用はニコチンに比べると多少低いものの、これまで報告されている結合実験の結果よりも、よりニコチンに近い反応性を示した。以上より、ネオニコチノイドはヒトの発達期の脳へニコチン様の悪影響を及ぼすことが示唆され、その結果を2012年PlosOne、欧州神経科学学会で発表した。
今年度はラット新生仔の小脳、胎仔の海馬、大脳皮質の培養神経細胞にこれらのネオニコチノイドとニコチンを添加して培養し、シナプス形成期にmRNAを抽出して、DNAマイクロアレイにて網羅的に遺伝子発現を解析したところ、神経回路形成に関わる多数の遺伝子発現に変化が確認された。この結果を2012年環境ホルモン学会で発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定では、環境化学物質としてネオニコチノイド系農薬以外に、有機リン系農薬や環境ホルモン作用のあるビスフェノールAについても行う予定であったが、DNAマイクロアレイなどに費用がかさむことから、これまでの実績のあるネオニコチノイド2種と子どもの発達への影響が確認されているニコチンに絞ったが、その分信頼できる結果が得られたと総括している。使用した培養神経細胞は小脳だけでなく、海馬、大脳皮質を用いて、幅のある検討を行っている。ネオニコチノイド投与によって変動した遺伝子発現のうち、いくつかの遺伝子にターゲットを絞ってから、リアルタイムPCRやタンパク発現によって詳しい解析を進める予定だが、まだ十分に標的が絞り切れていない段階である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は昨年の結果を受け、発達期の神経細胞においてネオニコチノイドなどの農薬曝露によって変動する遺伝子群を解析して、シナプス形成や神経回路形成に関わる遺伝子をターゲットとして絞り込み、いくつかの遺伝子についての詳しい検討を進める予定である。解析にはマイクロアレイ解析ソフトとして実績のあるGeneSpring（当研究所に設置済み）を用い、意味のある遺伝子については、リアルタイムPCRで発現変動を確認し、さらにタンパク発現の変動もウエスタンブロットや免疫染色などで確認する。また解析結果によっては、再現性のある信頼できるデータを得るようDNAマイクロアレイの実験を再度行う。同時に論文を書き始め、できるだけ早く国際専門誌に投稿できるよう準備する。また余力があれば、他の環境化学物質にも取り組む。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度は昨年のDNAマイクロアレイの結果を解析して、ネオニコチノイドなどの農薬によって変動する遺伝子を絞り込み、リアルタイムPCRやタンパク発現をウエスタンブロットで確認する予定である。また場合によってはDNAマイクロアレイの解析も追加実験する。したがって、リアルタイムPCRやウエスタンブロット、DNAマイクロアレイに研究費を使用する予定である。なお、論文も合わせて書き、投稿予定なので、論文の校閲や掲載費用などにも研究費を使用する。6月には日本神経科学大会で本研究を発表予定なので、旅費も使用する。予算配分は以下の通り。
1. リアルタイムPCR (600,000円)、 2. ウエスタンブロット（400,000円）、3. DNAマイクロアレイ (200,000円)、4. 論文校閲、掲載費など (200,000円)、5. 学会参加にかかる旅費 (100,000円)
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