| 研究課題/領域番号 |
24510318
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 公益財団法人野口研究所 |
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研究代表者 |
水野 真盛 公益財団法人野口研究所, 研究部, 研究員 (40271506)
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| 研究分担者 |
藤田 雅也 公益財団法人野口研究所, 研究部, 研究員 (20321672)
川上 宏子 公益財団法人野口研究所, 研究部, 研究員 (40320254)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | バイオプローブ / 糖鎖 / フルオラス / 抗糖鎖抗体 / ファージディスプレイ |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、糖鎖シルセスキオキサン型プローブを用いるハイスループットな抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの構築である。本プローブは抗原部位の糖鎖と、クラスター化のコア部位となるシルセスキオキサン（以下POSS）、固定化部位のフルオラス基の３つの部位から成る有機・無機ハイブリッド型プローブである。特に抗原部位の糖鎖以外はバイオイナートなシルセスキオキサンとフルオラス基であることから抗原性を有さず、また非特異的な吸着が抑制できる。さらにプローブ中で糖鎖をクラスター化するため十分な強度の結合定数を有するようになるため、ファージディスプレイ法と組み合わせることで選択性の高い抗糖鎖抗体の迅速スクリーニングが可能となる。
２４年度は①：フルオラスタグ含有POSSコアブロックの合成と、②：①で合成したフルオラスタグ含有POSSブロックに導入する糖鎖部位の合成、を行った。
まず①についてはPOSSブロックの合成に付いて種々検討を行った結果、当初計画の構造である７つのアルキン基を有するPOSSブロックの合成は非常に困難であることが明らかとなった。そこで糖鎖導入部位用官能基、及びフルオラスタグ導入部位用官能基について様々な官能基を用いてPOSSブロックの合成の検討を行った。その結果、糖鎖部位を導入する官能基としてビニル基を、フルオラスタグ部位を導入する官能基としてアジド基を有するPOSSブロックの合成に成功した。
次に②については、POSSブロックに対して糖鎖部位をチオールのラジカル付加により導入することを念頭に、末端にチオール基を、かつスペーサー部位にPEG鎖を有する糖鎖誘導体の合成を行った。糖鎖としては実施計画通りラクトースを選択した。合成法について種々検討を行った結果、末端にチオール基を、かつスペーサー部位にPEG鎖を有するラクトース誘導体の合成に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の目的は、糖鎖シルセスキオキサン型プローブを用いるハイスループットな抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの構築である。本プローブは抗原部位の糖鎖と、クラスター化のコア部位となるシルセスキオキサン（以下POSS）、固定化部位のフルオラス基の３つの部位から成る有機・無機ハイブリッド型プローブである。特に抗原部位の糖鎖以外はバイオイナートなシルセスキオキサンとフルオラス基であることから抗原性を有さず、また非特異的な吸着が抑制できる。さらにプローブ中で糖鎖をクラスター化するため十分な強度の結合定数を有するようになるため、ファージディスプレイ法と組み合わせることで選択性の高い抗糖鎖抗体の迅速スクリーニングが可能となる。
２４年度は①：フルオラスタグ含有POSSコアブロックの合成と、②：①で合成したフルオラスタグ含有POSSブロックに導入する糖鎖部位の合成、を行った。
まず①についてはPOSSブロックの合成に付いて種々検討を行った結果、当初計画の構造である７つのアルキン基を有するPOSSブロックの合成は非常に困難であることが明らかとなった。そこで糖鎖導入部位用官能基、及びフルオラスタグ導入部位用官能基について様々な官能基を用いてのPOSSブロックの合成の検討を行った。その結果、糖鎖部位を導入する官能基としてビニル基を、フルオラスタグ部位を導入する官能基としてアジド基を有するPOSSブロックの合成に成功した。
次に②については、POSSブロックに対して糖鎖部位をチオールのラジカル付加により導入することを念頭に、末端にチオール基を、かつスペーサー部位にPEG鎖を有する糖鎖誘導体の合成を行った。糖鎖としては実施計画通りラクトースを選択した。合成法について種々検討を行った結果、末端にチオール基を、かつスペーサー部位にPEG鎖を有するラクトース誘導体の合成に成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
２５年度は①フルオラスタグ含有糖鎖POSSプローブ、及び②フルオラス相互作用による糖鎖POSSプローブの固定化、更に③ＧＭ３型糖鎖部位の合成を行う。
①については、２４年度に合成したシルセスキオキサンコアブロックに対してフルオラス部位をHuisgen 反応により、糖鎖部位をラジカル付加によりそれぞれPOSSコアブッロックへ導入し、フルオラスタグ含有糖鎖POSSプローブの合成を行う。特に糖鎖部位の導入については24年度に合成したラクトース誘導体を用い、付加反応の条件について検討し、糖鎖導入の最適条件を決定する。②についてはPTFE製プレートに①で合成した糖鎖POSSプローブをフルオラス相互作用で固定化する。本研究では固定化の溶媒、濃度、洗浄溶媒の種類について検討を行い、プローブの固定化量を測定する。固定化量の測定には酵素標識あるいは蛍光標識レクチンなどを用いる。もし、パーフルオロオクチル基では固定化が不十分、あるいは洗浄工程での剥離などの結果が得られた場合はパーフルオロオクチル基を複数本有する糖鎖POSSプローブを合成し、固定化の検討を行う。③については２４年度合成したラクトース誘導体の合成を参考に行う。
２６年度は④プローブ構造の最適化、及び⑤ファージディスプレイ法による抗糖鎖抗体スクリーニングシステムの構築を行う。⑤については平成25年度②の結果を基に、クラスター効果を保ちつつ、抗体の結合を妨げない適度な長さのスペーサーの検討を行い、プローブ構造の最適化を行う。⑥については、⑤で得られた糖鎖POSSプローブを固定化したデバイスを用い、Ｍ１３ファージを用いてファージディスプレイ法により抗糖鎖抗体のスクリーニングを行う。もしpositiveなファージが得られにくい場合はスペーサー部位にアジュバント様スペーサーを有するプローブを合成する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
25年度は設備備品として低温恒温水槽の購入を計画している。25年度の研究計画であるGM3糖鎖合成においてシアル酸のグリコシル化反応を行う。この反応は－30℃以下の低温化で行う必要がある。ドライアイス―有機溶媒による冷却では温度維持に安定性がなくグリコシル化反応には不向きのため、安定した温度管理ができる低温恒温水槽の使用が必要である。そこで、本装置に設備備品代として63万円の支出を予定している。またフルオラス科学、及び糖鎖工学に関する内外の学会に参加し研究成果の発表や研究者との意見交換を行うため、旅費として40万円の支出を予定している。それ以外は研究遂行のために試薬類や器具類、論文投稿等の消耗品費としての使用を計画している。
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