研究課題
２４年度に構築した探索系を用いて結合を阻害する物質の探索を２５年度に引き続き実施した。阻害剤の候補化合物群は研究室にすでに保有している化合物ライブラリーから本年度は約１．５万の精製化合物を利用した。蛍光タンパク質を用いたアッセイ系で約３０の化合物が１４-３-３σタンパク質と標的リン酸化ペプチドの結合を５０％以上阻害した。そこで、これらの化合物について、ＨＥＫ２９３細胞で発現したヒトＷＥＥ１タンパク質と１４-３-３σタンパク質との結合を阻害する活性によって二次評価を行った。ヒトＷＥＥ１タンパク質はＧＳＴタンパク質との融合タンパク質としてＨＥＫ２９３細胞で発現し、その細胞抽出液を、１４-３-３σタンパク質を発現させた大腸菌の抽出液と混ぜた後にグルタチオンビーズによってプルダウンし、結合した１４-３-３σタンパク質をＳＤＳ電気泳動、ＣＢＢ染色によって定量した。この二次評価系で３化合物が終濃度１０μMで結合を５０％以上阻害した。次にこれらの化合物について他の６種類のヒト１４-３-３タンパク質について結合を阻害するか否かの評価を行った。他の６種類のヒト１４-３-３タンパク質をコードするｃＤＮＡを単離し、大腸菌発現ベクターに導入し、タンパク質の発現を行い上述の１４-３-３σと同様の結合評価系を構築した。３つの化合物については、どれも他の１４-３-３も同様に阻害することが確認された。しかし、目標とする1μＭより低い５０％阻害濃度の化合物の存在に関しては、再現性が得られていない。しかし、探索系は期待通りに機能していることが確認できたので２７年度に研究期間を延長し探索を行い、より強い活性を有する物質取得を目指すこととした。
3: やや遅れている
上述のように、構築した阻害物質探索系を用いて化合物探索を行い期待される化合物が得られてきているが、活性の強さが期待よりも弱い。そこで研究期間を延長しより強い物質の探索を目指すこととした。
探索系が構築できて弱いながらも期待される活性を有する化合物が得られてきているので、さらに強い活性を有する化合物取得を目指して探索を行う。得られてくる物質を用いて１４-３-３タンパク質の細胞周期進行制御に関する役割を解析する研究計画を推進する。
26年度も24年度に構築した14-3-3タンパク質のリン酸化依存性結合探索系をもちいて、結合阻害を起こすタンパク質の探索を行った。年度後半になって比較的強い阻害活性を有する可能性のある物質が得られておりその再現性を確認するなどの実験を行った。そこで、計画を変更し本年度での研究終了および発表を延期し、これらの物質についてのさらなる解析を行い、期待される結果が得られたら当初の予定どおり海外学会での発表を行う事とすることにした。
阻害物質探索の継続とこれまでに得られている物質の作用解析を行う。期待通りの結果が得られた場合には海外学会発表を次年度に行う事とし、未使用額は２７年度の探索研究および旅費に充てることとした。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 謝辞記載あり 1件)
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