研究課題
動物におけるヘム生合成経路の第3番目の酵素であるヒドロキシメチルビランシンターゼ(HMBS)は,ジピロメタン補因子をもち,4分子のポルホビリノーゲン(PBG)を順次縮合して鎖状テトラピロールであるヒドロキシメチルビランを合成する。本研究では,HMBSにおけるこの縮合過程について, 酵素化学的および構造生物学的な手法による解明を目指した。まず,ヒトHMBSを大腸菌で大量発現させ,多段階のカラムクロマトグラフィーで精製し,さらにmono Qカラムで分離して複数のピークを分取した。質量分析により,各ピーク画分はホロ型および基質が1~3個結合したES1~ES3型HMBSに対応することが確認できた。PBGのピロール環上にヨウ素を導入した2-ヨードポルホビリノーゲン(2-I-PBG)を用いて,ホロ型HMBSの反応速度論解析をしたところ,2-I-PBGが非競合阻害の様式で反応を阻害し,阻害定数Kiは5 μMであった。また,ホロ型HMBSを20 ℃で結晶化し,大型放射光施設SPring-8のビームラインBL44XU等を用いて構造解析をしたところ,既報でディスオーダーしていた領域の主鎖の構造を2.2 A分解能で決定できた。還元剤のジチオトレイトールを沈殿剤に添加して補因子の酸化を抑えると,結晶化途中での結晶の着色を防止でき,良好な回折像が得られた。さらに,HMBSの単結晶への2-I-PBGのソーキングによって酵素-阻害剤複合体の結晶を調製し,2.4 A分解能までのX線回折データを収集した。構造解析の結果,2-I-PBGがジピロメタン補因子の遠位側ピロール環の近傍に結合することが明らかとなった。この結果は,基質類似体の2-I-PBGがHMBSの補因子周辺に結合し,活性部位において少なくとも補因子と1つ目の基質PBGとの間での縮合反応を妨げうることを示唆している。今後,PBGが複数連結したES2~ES4型に対応するHMBS-基質(類似体)複合体の立体構造を解明して,HMBSに対するPBGの結合機構についてさらに検討する予定である。
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