| 研究課題/領域番号 |
24570003
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| 研究機関 | 埼玉大学 |
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研究代表者 |
松本 幸次 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (00119140)
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| 研究分担者 |
原 弘志 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (00173071)
松岡 聡 埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (90509283)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 細胞膜脂質ドメイン / 大腸菌 / 枯草菌 / 酸性リン脂質 / カルジオリピン / ホスファチジルグリセロール / ClsA / UgtP |
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| 研究実績の概要 |
26年度の本研究計画は以下の2つの方向の課題に分けて研究を実施した。
課題 1, 新規糖脂質プローブの開発と細胞表層の脂質分布： 糖脂質合成酵素UgtPが、細胞分裂タンパク質EzrA およびSpoIIEと相互作用することを見出している。このように大きな進展が、一昨年度にみられたことから、プローブ探索は、UgtP の局在とSpoIIEの相互作用の解析に重点をシフトすることとしている。UgtP欠損細胞では、胞子形成時の不等隔壁形成に重要な働きをもつSpoIIEリングの形成が遅延することが見出され、昨年度から胞子形成の同調条件を検討し、SpoIIEリング形成の遅延の解析をすすめている。本年度は、糖脂質の細胞膜における役割に新たな知見を得た。即ち、ugt欠損株で見られるECFσ因子の活性化は、σ因子を膜に補足することにより活性を発揮させないアンチσタンパク質の働きが糖脂質に依存しており、糖脂質欠損がアンチσの働きを弱めることを明らかにした。
課題 2, 脂質合成酵素が細胞分裂隔壁に局在する機構の解明：カルジオリピン合成酵素ClsA とMinD には細胞膜に結合する両親媒性のαへリックスMTS (membrane-targeting-sequence) が存在する。26年度は、ClsAのCOOH末端にある2つのMTS配列の解析を行った。MTSはそれぞれ単独で隔壁膜に結合することを証明し、ClsA全長から、2つのMTSを欠失すると局在できず、いずれか1つを欠失させた場合には局在は維持された。また、COOH末端には-SPIL (-SxxL) 配列が細菌のClsA酵素に広く保存されており、最末端の唯1つのアミノ酸の欠失によって酵素活性が失われ、GFPの付加によっても活性が失われた。これにより、COOH末端の配列はClsA内部にある活性中心部位と深く係る可能性を示唆した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
課題 1, 胞子形成のための不等隔壁形成に重要な働きをもつSpoIIEリングの形成がUgtP欠損細胞では遅延することを見出していることから、プローブ探索は、一時中断し、糖脂質合成酵素UgtP の局在とSpoIIEタンパク質との相互作用の解析に重点をシフトすることとした。昨年度につづき、系の十分な同調化を計るため、胞子形成の同調条件を検討した。本年度は、糖脂質の細胞膜における新たな役割として、ECFσ因子を捕捉してその働きを制御する、アンチσ因子の働きが糖脂質の存在により維持されていることを新たに見出した(Genes genet. Syst.誌に受理)。糖脂質の細胞膜における新たな機能を発見したものであり、極めて大きな成果である。
課題 2, MinDのCOOH末端にある、2両つの親媒性のαhelix（MTS）が枯草菌以外の多くの細菌のMinDでも同様に2つ存在することを見出し、この2つのMTS配列は、分裂位置に豊富に存在する酸性のリン脂質と直接相互作用することを、昨年度までに、phase partition法によるin vitro実験で明らかにした。抗体の導入により、定量的解析を可能とし、カルジオリピンとホスファチジルグリセロールによるMinDとの直接相互作用は、ともに用いるリン脂質の含有割合に依存する可能性を示唆することができた。また、同様に酸性リン脂質に親和性があると考えられる大腸菌ホスファチジルセリン合成酵素についても、phase partition実験の有効性を示した。26年度の成果は、ClsAのCOOH末端にある2つのMTS配列の役割は、長年にわたって不明瞭のままであったが、この2つのMTSがともに、それぞれ独立して隔壁局在の機能を持つことを丁寧に証明したことである。この成果は、投稿論文を鋭意準備しており、近々に投稿する見込みである。
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| 今後の研究の推進方策 |
脂質合成酵素が細胞分裂隔壁に局在する機構の解明 UgtP酵素タンパク質はEzrA およびSpoIIEタンパク質と相互作用する。このことを端緒とし、胞子形成のための不等隔壁（FtsZリング）形成に重要な働きをもつSpoIIEリングの形成がUgtP欠損細胞では遅延することを見出している。胞子形成時期の同調化を昨年度と同様に丁寧に再検討したのち、FtsZ リングとの共染色を含めた詳細な解析を行うことを重点項目とし、SpoIIEリング形成過程においてUgtPタンパク質が果たす役割を明らかにする。
枯草菌MinD、カルジオリピン合成酵素ClsA のCOOH末端には、ともに細胞膜に結合する両親媒性の2つのαへリックス領域がタンデムに存在する。MinDのMTSはそれぞれカルジオリピンとホスファチジルグリセロールの含有割合に依存して、リン脂質-TritonX100ミセル相に移行する。ClsA酵素については、２つのMTSの役割を膜画分、細胞質画分へのClsAタンパク質の移行分布からin vivo 解析し、これらを総合することによってMTSの機能を考察する。これらMTSのアミノ酸配列改変による効果を解析し、局在に係わる必須の領域とアミノ酸配列を明らかにすることから酸性リン脂質との相互作用の本質を明らかにする。COOH最末端の保存配列が持つClsA酵素活性における役割についても詳細に検討する。また更に、顕微鏡観察、in vitro phase partition 解析、細胞分画を行い、実際に膜、隔壁膜局在をもたらすMTS構造上の特性について比較解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
UgtP欠損細胞で見出された、胞子形成のための不等隔壁形成に重要な働きをもつSpoIIEリング形成の遅延の確認解析を行うこと重点とし、同調条件等の検討を行ってきた。このため糖脂質に特異性を示して結合するペプチドの解析の為の、蛍光修飾ペプチドの合成委託等は、上記を確認してから検討することとした。また更に、脂質合成酵素が細胞分裂隔壁膜に局在する機構の解明では、ClsA及びMinDのタンパク質COOH末端にある膜結合領域MTS及びClsA最末端の保存配列の役割について、興味深い結果が得られている。加えて糖脂質の膜における新規な役割も見出している。これらの成果を詳細に確認にするため、COOH末端が酵素活性に果たす役割の更なる解析と、細胞を膜画分、細胞質画分に分画し、酵素タンパク質の各画分への分布割合をWestern解析等により、丁寧に時間をかけて宿主菌株、培養条件等の検討をする必要があった。このため次年度使用金額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
MinD及びClsA COOH末端部のアミノ酸配列の詳細な酵素活性解析には、変異DNAクローンを得るためのオリゴDNAの依頼合成、PCR酵素、制限酵素、DNA塩基配列解析キットなどの遺伝子解析試薬、また、脂質のTLC分析のための試薬、標準脂質、TLCプレート等を購入して実験を行う。また、これらタンパク質を細胞分画を用いて、膜への局在割合などをWesternで解析を行うため、GFP抗体HRP抗体-ECL Advance 発光試薬キット等の種々の試薬を購入する。
これら試薬の購入、および、成果の学会で発表、論文発表を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとする。
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