| 研究課題/領域番号 |
24570044
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
福原 敏行 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (90228924)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | RNA干渉 / ダイサー / シロイヌナズナ / DCL3 / DCL4 |
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| 研究概要 |
植物には、４種類のダイサーが存在し、遺伝子発現制御、エピジェネティック制御、ウイルス感染防御など多くの重要な生体反応に関わっている。本研究では、４種類のダイサーの中でもRNA依存DNAメチル化(RdDM)に関与するDCL3とmRNAの切断(RNA干渉）に関与するDCL4の酵素活性および小分子RNAの生成機構を解析し、ダイサーの機能分化を明らかにすることを目的とした。
モデル植物シロイヌナズナの芽生え由来の粗抽出液を酵素画分、30, 37, 50, 500塩基対の２本鎖RNAを基質として反応をおこない解析したところ、24塩基および21塩基の小分子RNAの生成を確認した。DCL3変異体およびDCL4変異体由来の粗抽出液を用いた解析から、DCL3およびDCL4がそれぞれ24塩基および21塩基の小分子RNAを生成したことを確認した。このように、植物の生体防御に中心的な役割を果たすと考えられる２種類のダイサー(DCL3, DCL4)の活性を簡便に検出することに成功した。また、DCL3は30-50塩基の短い２本鎖RNAを好んで切断するが、DCL4は50塩基以上の長い2本鎖RNAを好んで切断することがわかった。
さらに、種々の反応条件で、ダイサー活性を測定したところ、ダイサー活性には、ATPやMgイオンが必要であることなど、ヒトやショウジョウバエのダイサーで知られている特性と同じであった。一方、種々の塩(NaCl)濃度でダイサー活性を測定したところ、DCL3は約150 mMの塩濃度に至適塩濃度があるのに対し、DCL4では塩により活性が阻害されることがわかった。このように、生体内で機能が異なる２種類のダイサー（DCL3とDCL4）は、基質の認識機構や至適塩濃度などが異なることで機能分化していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
当初は、生体内で24塩基のsmall interfering RNA (siRNA)の生成を担い、RNA依存DNAメチル化（RdDM）に関与するDCL3の活性を詳細に検討することが容易ではないと予想したが、短い2本鎖RNAを基質に用いることでDCL3の活性を簡便かつ高感度で検出し、生化学的に詳細に解析することが可能となった。その結果、既に活性を検出していたDCL4の活性とDCL3の活性を生化学的に比較解析することができた。
DCL3は30-50塩基の短い２本鎖RNAを好んで切断するが、DCL4は50塩基以上の長い2本鎖RNAを好んで切断すること、DCL3の至適塩濃度は約150 mMであるのに対し、DCL4は塩により活性が阻害されること、DCL3は、3’末端が１塩基突出した２本鎖RNAを好んで切断するが、DCL4は、平滑末端、3’末端１塩基もしくは２塩基突出の基質に対して同等の活性を有すること等がわかった。このように、生体内で機能が異なる２種類のダイサー（DCL3とDCL4）は、基質認識機構や至適塩濃度などが異なることで機能分化していることが示唆された。
研究開始１年目で、DCL3とDCL4の基質の認識機構や至適塩濃度について興味深い結果を得ることができ、これら２種類のダイサーの生体内での機能分化(RNA依存DNAメチル化とRNA干渉)は、２種類のダイサーの基質認識機構の違いが原因であることが示唆されたことは予想以上の大きな進展である。
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| 今後の研究の推進方策 |
１年目の研究成果として生化学的 (in vitro) な手法で明らかにした２種類のダイサー（DCL3とDCL4）の基質認識機構が、生体内（in vivo) においても適用できるかどうかを確認する研究を推進する。さらにDCL3およびDCL4により生成されsiRNAがDNAのメチル化(RNA依存DNAメチル化)およびmRNAの切断(RNA干渉）を生体内で誘導できるかどうかを解析する研究を推進する。
具体的には、シロイヌナズナからプロトプラストを調製し、人工的に合成した種々の２本鎖RNAをプロトプラスト（細胞）に導入し、その後のダイサー活性による切断産物（siRNA）と誘導される生体防御反応（DNAのメチル化もしくはmRNAの切断）を解析する。導入した基質・２本鎖RNAの構造と生成したsiRNAのサイズや誘導される生体防御反応の関係を明らかにし、試験管内の実験系(in vitro)の研究成果と生体内での実験系(in vivo)の研究成果を総合的に解析することによって、DCL3とDCL4の酵素活性と機能分化(RNA依存DNAメチル化とRNA干渉）の関係について明らかにする。
また、DCL1, DCL2の酵素活性を検出する実験系の確立を目指し、DCL3とDCL4の活性と比較解析することを目標に研究を進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本年度の所要額(1,820,000円)と実支出額(1,733,143円）の差額（86,857円）は、次年度の物品費に繰り入れて適正に支出する計画である。
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