植物のダイサーの酵素活性と機能分化

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24570044
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 福原 敏行 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (90228924)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: ダイサー / ２本鎖ＲＮＡ / DCL3 / DCL4 / 栄養欠乏ストレス

研究実績の概要

植物には、４種類の2本鎖RNA切断酵素・ダイサーが存在し、遺伝子発現制御、トランスポゾンの転移抑制、ウイルス感染防御など多くの重要な生体反応を担っている。本研究では、４種類のダイサーの中で、DNAメチル化を担いトランスポゾンの転移抑制に関与するDCL3と、RNA干渉を担いウイルス感染防御に関与するDCL4の酵素活性を解析し、ダイサーの機能分化を明らかにすることを目的とした。平成24～25年度の研究により、シロイヌナズナ芽生え由来の粗抽出液を酵素画分とし、32Pで末端標識した50塩基の2本鎖RNAを基質に用いることで、簡便に２種類のダイサー（DCL3とDCL4）の活性を同時に検出する実験系を確立した。
平成26年度は、本実験の特徴を生かし、種々の栄養欠乏ストレスを処理したシロイヌナズナを用いて２種類のダイサー活性を解析した。この実験系により、イオウ欠乏ではDCL4の活性が低下すること、DCL4の活性が生体内の酸化還元で制御されていること、リン酸欠乏ではDCL3の活性が低下し、DCL3は、生体内のリン酸濃度により調節を受けていることが示された。これらの実験結果から栄養欠乏ストレスがダイサーの活性調節を通してDNAメチル化とRNA干渉に影響を及ぼすことが示唆された。
また、種々の２本鎖RNAをプロトプラスト（裸の細胞）に導入し、その後のDCL4による切断産物（siRNA）と誘導されるRNA干渉反応を解析した。その結果、導入する２本鎖RNAが長い方が効率よくRNA干渉を誘導すること、21塩基対の２本鎖RNA (siRNA)を導入する場合は、5’末端塩基の種類によりRNA干渉誘導効率が異なることなどが明らかとなった。このようにダイサーの機能分化と活性調節の機構の一端を明らかにすることができた。

研究成果

• [雑誌論文] A simple and rapid method for viral dsRNA isolation from plant and fungal tissue (2015)
  • 著者名/発表者名: Okada R, Kiyota E, Moriyama H, Fukuhara T and Natsuaki T.
  • 雑誌名: Journal of General Plant Pathology 巻: 81 ページ: 103-107
  • DOI: 10.1007/s10327-014-0575-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rapid detection of Magnaporthe oryzae chrysovirus 1 dsRNA from fungal colonies on agar plates and lesions of rice blast (2015)
  • 著者名/発表者名: Urayama S, Katoh Y, Fukuhara T, Arie T, Moriyama H and Teraoka T.
  • 雑誌名: Journal of General Plant Pathology 巻: 81 ページ: 97-102
  • DOI: 10.1007/s10327-014-0567-6
  • 査読あり
• [雑誌論文] Two types of genetic carriers, the IncP genomic island and the novel IncP-1β plasmid, for the aac(2′)-IIa gene that confers kasugamycin resistance in Acidovorax avenae subsp. Avenae (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshii A, Omatsu T, Katayama Y, Koyama S, Mizutani T, Moriyama H and Fukuhara T.
  • 雑誌名: Molecular Plant Pathology 巻: 16 ページ: 288-300
  • DOI: 10.1111/mpp.12182.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Use of S1 nuclease in deep sequencing for detection of double-stranded RNA viruses (2015)
  • 著者名/発表者名: Shimada S, Nagai M, Moriyama H, Fukuhara T, Koyama S, Omatsu T, Furuya T, Shirai J, Mizutani T
  • 雑誌名: Journal of Veterinary Medical Science 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 1292/jvms.14-0607
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] イネいもち病菌の病原力（性）と菌類ウイルスの作用とその応用 (2015)
  • 著者名/発表者名: 浦山俊一・Le Minh Tuong・岡田亮・加藤優・福原敏行・有江力・森山裕充・寺岡徹.
  • 雑誌名: 土と微生物 巻: 68 ページ: 3-5
  • 査読あり
• [学会発表] Efficiency of gene silencing by infection of various dsRNAs in Arabidopsis protoplasts (2015)
  • 著者名/発表者名: 柿山 明香，古崎 利紀，石井 一夫，森山 裕充，福原 敏行
  • 学会等名: 第56回日本植物生理学会年会
  • 発表場所: 東京農業大学
  • 年月日: 2015-03-16 – 2015-03-18
• [学会発表] 硫黄欠乏ストレスで栽培したシロイヌナズナ由来粗抽出液中でのダイサー活性の変化 (2015)
  • 著者名/発表者名: 瀬田 淳，大津 直子，横山 正，金澤 章，森山 祐充，福原 敏行
  • 学会等名: 第56回日本植物生理学会年会
  • 発表場所: 東京農業大学
  • 年月日: 2015-03-16 – 2015-03-18
• [学会発表] 植物における発生段階依存的な小分子RNA 産生活性の解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 田原 緑，大谷 美沙都，金勝 一樹，森山 裕允，福原 敏行
  • 学会等名: 第56回日本植物生理学会年会
  • 発表場所: 東京農業大学
  • 年月日: 2015-03-16 – 2015-03-18
• [学会発表] 塩ストレス条件下およびストレスホルモン処理におけるシロイヌナズナのダイサーの2 本鎖RNA 切断活性の変化 (2015)
  • 著者名/発表者名: 西堀 有紀，田原 緑，森山 裕充，福原 敏行
  • 学会等名: 第56回日本植物生理学会年会
  • 発表場所: 東京農業大学
  • 年月日: 2015-03-16 – 2015-03-18
• [学会発表] アントシアニン過剰蓄積系統を用いた二本鎖RNA 結合タンパク質 DRB3 の機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 松崎 拓真，薄井 智之，森山 裕充，福原 敏行
  • 学会等名: 第56回日本植物生理学会年会
  • 発表場所: 東京農業大学
  • 年月日: 2015-03-16 – 2015-03-18
• [学会発表] プロトプラストを用いた様々なdsRNAの導入によるRNA干渉効果の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 柿山 明香、長野 秀昭、森山 裕充、福原 敏行
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [学会発表] 植物のダイサーの二本鎖RNA切断活性の組織特異性及び発生段階との関係 (2014)
  • 著者名/発表者名: 田原緑、大谷美沙都、森山裕充、福原敏行
  • 学会等名: 日本植物学会 第78回大会
  • 発表場所: 明治大学
  • 年月日: 2014-09-12 – 2014-09-14
• [学会発表] The effect of dsRNA structures on RNA interference in Arabidopsis protoplasts (2014)
  • 著者名/発表者名: Sayaka Kakiyama, Hideaki Nagano, Hiromitsu Moriyama and Toshiyuki Fukuhara
  • 学会等名: 25th International Conference on Arabidopsis Research
  • 発表場所: University of British Columbia, Vancouver, CANADA
  • 年月日: 2014-07-28 – 2014-08-01
• [学会発表] Nutritional deficiency stresses affect DCL3 and DCL4 activities in Arabidopsis thaliana (2014)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Seta, Hideaki Nagano, Akihito Fukudome, Naoko Ohkama-Ohtsu, Tadashi Yokoyama, Hiromitsu Moriyama and Toshiyuki Fukuhara
  • 学会等名: 25th International Conference on Arabidopsis Research
  • 発表場所: University of British Columbia, Vancouver, CANADA
  • 年月日: 2014-07-28 – 2014-08-01
• [学会発表] dsRNA-cleaving activities of DCL3 and DCL4 are changed with depending on organs or developmental stages in Arabidopsis thaliana and Brassica rapa (2014)
  • 著者名/発表者名: Midori Tabara, Misato Ohtani, Hiromitsu Moriyama and Toshiyuki Fukuhara
  • 学会等名: 25th International Conference on Arabidopsis Research
  • 発表場所: University of British Columbia, Vancouver, CANADA
  • 年月日: 2014-07-28 – 2014-08-01
• [備考] 東京農工大学細胞分子生物学研究室ホームページ
  • URL: www.tuat.ac.jp/~mcb/
• [備考] 東京農工大学研究要素集 RNA干渉を担う２種類のダイサー(DCL3, DCL4)活性の簡便な検出
  • URL: http://www.rd.tuat.ac.jp/activities/factors/search/20140325_02.html