研究課題
アフリカツメガエルの小腸では、変態期に上昇する甲状腺ホルモン（TH）の作用により幹細胞ニッチが形成され、その影響下で幼生型吸収上皮の一部が幹細胞へと脱分化する。この上皮脱分化を制御するニッチの分子レベルでの解明を目指し、本研究ではTH応答遺伝子の解析を進めている。本年度は、幹細胞出現時に上皮・結合組織間で起こるcell contactの分子基盤を明らかにするため、これまでに同定されているTH応答遺伝子のうち、遺伝子産物が細胞膜に存在する遺伝子群に注目して発現解析を行った。RT-PCRおよび免疫組織化学により、Notch1とそのリガンドJagged1、transient receptor potential (TRP) チャネルの１つであるTRPP1等が幹細胞出現と時間的に一致して発現が高まり、いずれも組織特異的な発現をすることを見出した。この他にも組織特異的に発現が上昇するTH応答遺伝子を複数同定した。また、昨年度より継続中の、幹細胞出現との密接な関連が示唆されているWnt5a/Ror2シグナル経路の機能解析を、小腸の培養アッセイ系を用いてさらに進めた。TH非存在下でWnt5aタンパク質を培養液に添加した場合には単層円柱上皮細胞の極性や形の変化が観察され、TH存在下で内在性Wnt5aの機能を抗体を用いて阻害した場合には幹細胞の出現が抑えられた。これらの結果は、Wnt5a/Ror2経路の活性化が上皮の幹細胞への脱分化に充分ではないが必須であることを示している。また、Wnt5aはRor2以外の受容体を介して細胞増殖を促進することを示す結果も得られた。さらに、Ror2発現細胞の細胞系譜を解析していくために必要なRor2プロモーターの単離にも成功した。
2: おおむね順調に進展している
TH応答遺伝子の発現解析を進め、予定通り、Notch1等のcell contactに関与する遺伝子候補を複数同定することができた。また、昨年度から継続中であった小腸培養アッセイ系を用いたWnt5a/Ror2経路に関わる遺伝子の機能解析を終了し、この経路が上皮の脱分化に関与することを示す結果を得ることができた。さらに、Ror2発現細胞の細胞系譜を解析していくためのトランスジェニックカエル（Tg）作製に必要な、Ror2のプロモーターの単離にも成功した。プロモーター領域が長かったため当初の予定よりも時間がかかってしまったが、この単離したRor2のプロモーターを使ってTgの作製が可能となった。全体として研究は順調に進んでいる。
最終年度にあたるため、下記の幹細胞制御の研究を推進すると伴に、データのまとめと発表を並行して行う。Notch１およびそのリガンド、TRPP1等について、cell contact部位でのより詳細な発現解析を進める。幹細胞出現と時間・空間的に最も密接な関連をもって発現する遺伝子から順に、小腸の培養アッセイ系を用いた機能解析を始める。当該遺伝子産物の活性化物質や阻害物質などを培養液に添加することにより、その機能をTH非存在下で促進、またはTH存在下で抑制し、当該遺伝子がcell contactや幹細胞の出現に及ぼす作用を検証していく。単離したRor2プロモーターの発現特異性をin vivoで確認した後、薬剤を加えた時にのみRor2発現細胞特異的にCreが活性化され、蛍光タンパク質DsRedが発現するようなDNAコンストラクトを設計する。このコンストラストを用いてCre-loxP導入Tgカエルを作製し、F0を使ったRor2発現幼生型上皮細胞の細胞系譜の解析に着手する。
すべて 2013 その他
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (4件) (うち招待講演 1件) 備考 (1件)
Endocrinology
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http://tlo.nms.ac.jp/researcher/762.html
