研究課題
光合成生物はその産物をグルカンの形で貯蔵するが、その構造はグリコーゲン、デンプン等のα-グルカンあるいは種々のβ-グルカンと多様性に富む。本研究ではその出現機構の解明を目的とし、３年目である本年度は、これまでの成果を受け以下の結果を得た。１. デンプン型→グリコーゲン型移行仮説の検証：原始紅藻Cyanidioschyzon（デンプン型）とCyanidium（グリコーゲン型）のグルカン合成関連酵素群の活性の比較から、デンプン型はイソアミラーゼによる枝揃えが活発に行われることにより形成される可能性が考えられた。そこで、Cyanidioschyzonの２つのイソアミラーゼ遺伝子について発現に対する光の影響を調べたところ、どちらの遺伝子も明条件で発現し、暗条件に移すと発現が抑制されたことから、これらの遺伝子産物はデンプンの分解というよりも合成に関与している可能性が示唆された。これらの遺伝子産物の機能を検証するため、現在、破壊株作製用プラスミドを作製して野生株を形質転換し、得られたコロニーに着いて破壊株の確認を進めている。２. ハプト植物のβ-グルカン合成酵素：円石藻ESTデータベースから得られた酵母KRE6ホモログクローンの全長塩基配列を決定したところ、β-グルカンとの結合に関与すると考えられるアミノ酸配列が保存されていた。このβ-グルカン合成酵素候補遺伝子の発現を抑制することにより機能を検証することを目指して、先ず抑制法の更なる検討を行った。抑制が検出しやすい系として、石灰化を指標に石灰化関連候補遺伝子の抑制を検討し、液胞が十分に発達した定常期のカルチャーで核酸導入率が高く、その後の生育にも問題ないことがわかった。次にこの方法をβ-グルカンに適用するために、少量の細胞でβ-グルカンを定量する方法を確立した。今後は、実際に発現抑制率の高い細胞でβ-グルカンを定量する。
2: おおむね順調に進展している
１については、注目しているCyanidioschyzonイソアミラーゼ遺伝子が２つともデンプン合成の起こる明期に発現していることが示され、これらの破壊株の作製•確認の準備も整った。２については、ESTクローンの全長塩基配列の結果からβ-グルカンを基質とする酵素である可能性が高まった。同時にゲノム配列の決定も進めている。また、β-グルカン合成酵素の同定には至っていないものの、遺伝子抑制法の再現性の向上というこれからの実験の大きな基盤を作ることができた。さらに、少量の細胞でβ-グルカンを定量する方法を確立することができた。以上のことからおおむね順調に進展していると思われる。
１については、Cyanidioschyzonのイソアミラーゼ遺伝子２個の破壊株を確認し、デンプン構造の変化を調べる。グリコーゲン型に変化しなかった場合には、イソアミラーゼのダブルミュータントやブランチングエンザイムの破壊株も作製し、影響を調べる。イソアミラーゼのダブルミュータントにCyanidium等グリコーゲン型のイソアミラーゼを導入することも検討する。２については、遺伝子発現抑制により円石藻KRE6ホモログの機能を推定する。β-グルカン合成酵素であることが証明されたら、酵素の反応産物を解析することにより反応機構を解明していく。
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Planta
巻: Published online: 03 March ページ: 1-10
10.1007/s00425-015-2270-z
Arch. Biochem. Biophys.
巻: 562 ページ: 9-21
10.1016/j.abb.2014.07.032.
