ＧＥＴ複合体による膜挿入機構の構造基盤

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24570126
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 山形 敦史 東京大学, 放射光連携研究機構, 助教 (20463903)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 結晶構造解析 / 膜タンパク質

研究実績の概要

1) Get3:TA 複合体の精製と結晶化
前年度までに光架橋を用いた Get3:TA 複合体の安定化を行ったが、架橋の効率を考えると結晶化に適しているとは考えられず、次にジスルフィド結合による架橋を試みた。pETDuet-1ベクターにクローニングされているヒスチジンタグ付き sbh2 と get3 遺伝子に対し、まず Sbh2 の膜貫通ヘリックス部位直下の Lys83 をシステインに置換した（Sbh2-Cys）。次に、Get3 の TA タンパク質結合部位と予測されるヘリカルドメインと呼ばれる部位の 47 個のアミノ酸を一つずつシステイン残基に置換した。5mL 培養スケールで、計47個の変異体 Get3 と Sbh2-Cysを全て Ni カラムにて精製し、非還元 SDS-PAGE にて解析したところ、３つの変異体で強い架橋が見られた。
2) Get1, Get2複合体の精製と結晶化
Get1, Get2 は複合体を形成することにより活性を持つが、精製した Get1, Get2 をそのまま混合しただけでは安定な複合体を形成できない。そこで、両者をつないだキメラ体を作製して、安定な複合体を得ることにした。Get2 のC末端に Get1のN末端をつなげたキメラ体 Get2-1 のコンストラクトを作製し、Sf9 細胞を用いて発現させた。膜画分を界面活性剤で可溶化した後、Ni カラムを用いて精製した。 HRV3cプロテアーゼによってGFPを切断した後、ゲルろ過カラムにて Get2-1 を精製した。このサンプルと Get3 を混合させてから、Get3:Get2-1 複合体をゲルろ過クロマトグラフィーによって精製したところ、Get3 ２量体に対し、Get2-1 一分子が結合した複合体を形成していた。現在、精製した Get3:Get2-1 複合体を用いて結晶化を行っている。

研究成果

• [雑誌論文] Structure of CYLD USP with Met1- or Lys63-linked diubiquitin reveal mechanism for dual specificity (2015)
  • 著者名/発表者名: Sato Y., Goto E., Shibata Y., Kubota Y., Yamagata A., Goto-Ito S., Kubota K., Inoue J., Takekawa M., Tokunaga F., and Fukai S.
  • 雑誌名: Nat. Struct. Mol. Biol. 巻: 22 ページ: 222
  • DOI: 10.1038/nsmb.2970
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Switching and emergence of CTL epitopes in HIV-1 infection (2014)
  • 著者名/発表者名: Han C., Kawana-Tachikawa A., Shimizu A., Zhu D., Nakamura H., Adachi E., Kikuchi T., Koga M., Koibuchi T., Gao GF., Sato Y., Yamagata A., Martin E., Fukai S., Brumme ZL., Iwamoto A.
  • 雑誌名: Retrovirology 巻: 11 ページ: 38
  • DOI: 10.1186/1742-4690-11-38.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] Bat3 の新規ドメインの構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 山形敦史、佐藤裕介、伊藤（後藤）桜子、深井周也
  • 学会等名: 日本結晶学会年会
  • 発表場所: 東京大学弥生講堂（東京都・文京区）
  • 年月日: 2014-11-01 – 2014-11-03
• [備考] 東京大学放射光連携研究機構生命科学部門
  • URL: http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/srro/SRROLifeSciDivJp2/Welcome.html