| 研究課題/領域番号 |
24570130
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
藤橋 雅宏 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (10397581)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 酵素反応 / 基質の歪み / 結晶構造 / ODCase / OMPDC |
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| 研究概要 |
ODCaseについては、生成物Uridine monophosphate (UMP)との複合体構造を1.03Å分解能で決定した。この分解能は、これまでにタンパク質構造データベース(Protein Data Bank)に登録されているODCaseの200個近い構造の中で、群を抜いて高い分解能である。この構造の観察により、UMPのpyrimidine環と活性残基であるLys72が互いに接触し、UMPのpyrimidine環は平面構造が崩れていること、Lys72はdouble conformationをとっていることを見いだした。また表面プラズモン共鳴法による分析を行い、Lys72をアラニン残基に置換したK72A変異体は、UMPとの結合力が野生型と比べて10の5乗倍上昇することを示した。これらの結果は、Lys72とUMPが互いに斥力を及ぼし合っていることを示す。
ODCaseの反応触媒機構に基質の歪みが利用されている仮説は古くから提唱されてきたが、歪められる置換基を持たないUMPが野生型OMPと強くは結合しないという実験事実が、この仮説の妥当性に大きな疑念を与えてきた。本研究によりこの疑念は解消され、ODCaseはその触媒反応に基質の歪みを利用している可能性が一段と高くなった。
その他、未だ役割の解明されていない基質周辺の保存残基の役割の解明や、連携研究者の開発したシミュレーション法による触媒機構の解析も進めた。
Cyc2 については、枯草菌由来の酵素について、結晶化に適した試料調製法の検討を行った。還元剤の添加、金属イオンの存在、付加する発現系タグの見直しなど、様々な検討を行ったが、未だ結晶を得ていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ODCaseについては、計画を上回る速度で研究が進展し、論文にまとめることが出来た。
Cyc2については、計画通りに精製条件の検討などを行ったが、結晶化に適した試料調製条件は見いだせていない。
以上を総合的に勘案し、「おおむね順調」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
ODCase については、構造解析・酵素学的アッセイ・計算機シミュレーションを併用した反応機構の解析を続ける。従来の研究では、別々のグループによる3つの手法による解析を、互いの実験条件の違いを考慮せずに解釈している例が目立つ。本研究では特にシミュレーションの基礎となる結晶構造の解釈・生化学的反応条件等について連携研究者と密に連絡を取り、反応機構の解釈に直結するシミュレーションを行う。また、未だ役割の解明されていない基質周辺の保存残基の役割の解明も、基質アナログ複合体のX線結晶構造解析や酵素学的アッセイによって進める。
Cyc2については、様々なBuffer条件下で酵素活性を測定できる系を構築する。また、これまでの試料は大腸菌を用いて大量発現させてきたが、本来の宿主である枯草菌の発現系を活用することで、性質の変化が無いかを確かめる。これらの方法により、結晶化に適した試料を得る。以上の方法でも良い試料が得られない場合は、近縁の菌株由来のCyc2 ホモログをターゲットとして、連携研究者の協力を得て活性を確認した上で、構造解析に取り組む。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本研究費の繰越は、前年度に前倒し請求したうちの一部である。この前倒し請求は、前年度の研究が順調に進んだため、本年度に行う予定であった研究の一部を先行して行うために行った。繰越研究費については、当初の予定通りの本年度の研究を行うために用いる。
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