研究課題
基盤研究(C)
細菌べん毛モーターの回転方向制御機構を明らかにするために、極低温電子顕微鏡による単粒子解析により回転方向の制御に関わるスイッチ複合体（Cリング）の構造解析を行う。特に回転方向変換時の構造変化を可視化するために左回転（CCW）または右回転（CW）に偏った回転を示す変異体のCリング付きフック基部体の高分解能構造解析と、回転反転スイッチであるリン酸化CheY (CheY-p)の結合したCリング付きフック基部体の構造解析を行い、それぞれの構造を比較することによって回転方向変換時の構造変化を可視化することを目的とする。本年度はCCW型、並びにCW型基部体構造の高分解能化に向けたデータ収集と解析方法の改良を行い、これによって以前の構造に比べて分解能が向上した。しかしその分解能ではすべてのスイッチタンパク質の結晶構造を当てるには不十分であった。そこで現構造から疑似原子モデル構築する時に各構成タンパク質の配置を正確に決めるためのラベル化複合体調製と解析を行った。FliGのN末端に蛍光蛋白質（フルオリン）を結合させた基部体の構造解析ではCリング構造上にフルオリン由来の密度が確認された。これは今後スイッチ複合体の擬似原子モデルを作成する際にFliGの位置を特定するために重要な位置ラベルとなる。並行してCheY-p結合型スイッチ複合体の構造解析を行うためにCheY-pと同等に作用することが知られている変異型CheY （D13K、Y106W）の精製方法を確立し、CheYは分子量が14KDaと小さく画像上で可視化が難しいため1.8 nmの金粒子でラベルした。現在この金粒子ラベル化CheY-pとCリングの複合体再構成条件の最適化を行なっている。これが確定出来ればリン酸化CheY (CheY-p)の結合したCリング付きフック基部体の構造決定ができ回転変化に伴う構造変化を議論することが可能となる。
3: やや遅れている
Cリングは個々の基部体（個々の画像）上で対称性のばらつきがあるために三次元構造の分解能向上を阻む。そこで、本年度はCCW、CW型の分解能を向上させるためにデータ収集を行い、それぞれ3万粒子と、2万5千粒子まで増やした。これらの画像をCリングの対称性（リングの直径）に従って分類し、それぞれの対称性ごとに解析した。また対称性の違う領域（MリングとCリング）の混ざりあった基部体の粒子像はそのまま使用するとミスアライメントの原因になるため、それぞれの対称性の領域だけを残すマスクをかけた画像を用いてその対称性ごとに解析することで分解能の向上をめざした。これらの結果得られた三次元構造の分解能は向上した。しかし、現在の分解能（約1.8nm）は原子構造を当てはめるには十分ではなかったため、出来上がった三次元構造に対するフィルターを工夫した結果、スイッチタンパク質のうちFliM、FliNに関してはその構造中の配置を予測することができた。しかしFliGに関してはちょうど対称性が異なる領域と重なる領域であるため構造が曖昧でありFliG結晶構造の当てはめができていない。そこで正確なFliGの配置を決めるためにFliGのN末端にフルオリンを融合した基部体の構造解析とFliF(FliGとともにMリングを形成する)のC末端領域とFliGのN末端領域の欠損、融合した各種変異体の作成を行った。フルオリンを融合したFliGの構造解析では600枚の粒子像からフルオリン由来と思われる密度が確認され、おおよその位置を予測できたが正確な原子構造の正確な当てはめはできていない。CheY-p結合型スイッチ複合体の再構成に関してはCheY-pと基部体との結合が弱く、現在のところ安定な複合体の再構成条件を確定できていない。このためCheY-p結合型スイッチ複合体の再構成は計画より進行が遅れている。
現在のCCW型とCW型の三次元構造はまだ分解能が低く、原子構造を大まかに置くことしかできていない。さらなる分解能の向上を目指し今後は解析に溶媒平滑化法を取り入れ構造解析を行う。またFliGのフルオリンラベル体に関してはデータ数が少ないため正確なFliGの位置を特定するには至っていない。そこでデータ収集を行い、粒子数を増やし、詳細なラベル位置の決定を行う。フルオリンラベルでFliGの位置決めができない場合、前年度作成した各種FliF-FliG欠損融合株を用いて構造解析を行いこれらのデータを統合して複合体中のFliGの配置と配向を正確に決める。CheY-p結合型スイッチ複合体の再構成に関しては相互作用が弱く現在のところ明確に複合体を検出できていない。そこで複合体の検出を簡便に行うために変異型CheYに蛍光蛋白質を融合したタンパク質を作成し、これを用いてまず結合条件の条件検討を行う。またグルタルアルデヒド等の固定剤を使用して複合体状態を固定する条件を検討する。この方法でも複合体が得られないときは変異体CheY の代わりにリン酸化CheYと同等に基部体に作用するBeF3-化CheYを調製し、これを用いて複合体再構成の条件検討を行う。CheY-p結合型スイッチ複合体の再構成条件が見つけられれば続いて電子顕微鏡像の収集と構造解析を行い、CheY-p結合型スイッチ複合体の構造を決定する。得られた３つの状態（CCW型、CW型、CheY-p結合型）のスイッチ複合体の構造に各スイッチサブユニット間の相互作用様式と、単粒子像解析で得られたラベル化基部体の立体構造マッピングの結果に基づき、結晶構造を当てはめスイッチ複合体の疑似原子モデルを構築する。CheY-p結合型、CCWまたはCW型変異体それぞれのCリング構造を比較し、モーター回転制御機構のモデルを構築する。
平成２５年度以降は各種変異体タンパク質の調製と、電子顕微鏡観察、並びに構造解析が中心となる。このため試料調製用に試薬とプラスチック製機器を購入する。また調製した試料を極低温顕微鏡で観察するために試料凍結用のエタンガス、電顕観察用グリッドを購入する。最終年度はそれぞれの構造に対する擬似原子モデル作成を行い、さらに構造解析の効率化を図るため計算機を購入する。また研究の成果を発表するために旅費と論文投稿料を申請する。
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すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 1件) 備考 (1件)
J. Struct. Biol.
巻: 182(1) ページ: 51-60
Proc. Natl Acad. Sci. USA,
巻: 109(50) ページ: 20643-8
10.1073/pnas.1215274109.
http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/labs/namba/wp_namba/?page_id=485
