| 研究課題/領域番号 |
24570140
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| 研究機関 | 大阪医科大学 |
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研究代表者 |
林 秀行 大阪医科大学, 医学部, 教授 (00183913)
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| 研究分担者 |
村川 武志 大阪医科大学, 医学部, 助教 (90445990)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 酵素反応機構 / ピリドキサールリン酸 / 反応速度論 / 遷移相速度論 / 反応中間体 / 副反応 / 反応特異性 |
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| 研究実績の概要 |
平成25年度までの研究でトレオニン合成酵素（TS）の後半過程についてはその全貌がほぼ明らかになってきたが，前半過程，すなわち基質のO-ホスホホモセリン（OPHS）からPLP-アミノクロトン酸アルジミン中間体までの過程が手付かずの状態であった。この過程を解明するためにはTSとOPHSの反応を追跡することが考えられるが，TSは極めて多段階の反応が連続しており，解析が困難であることが予想される。そこで，OPHSのアナログとして，2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸（AP5）を合成した。AP5はリン酸の脱離が起こらないため，エナミン中間体で反応が停止する。したがって，TSとAP5の反応で前半過程の大部分を再現することが可能である。TSとAP5の反応をフォトダイオードアレイを装備したストップトフロー分光器によって追跡したところ，482 nmにおいては3相性の変化が観察されたが，330 nmにおいては第2相に当たる変化の変化量が極めて少なかった。このことから，単純な逐次モデルではこの吸収スペクトル変化を説明することが困難であり，カルボアニオン中間体が生成したのち，ケチミン中間体への変化とは別に第2の外アルジミン中間体へ枝分かれをする経路が存在することが示された。この結果をAP5を結合したTSのX線結晶解析で得られた構造と照合したところ，AP5のホスホノ基からのプロトンがカルボアニオン中間体のCα位に移動する過程が第2相の変化の実体であることが考えられた。このことから，AP5のホスホノ基，そして基質OPHSのリン酸基はLys61のアミノ基と強い相互作用を行っており，Lys61のアミノ基が脱プロトン化した状態を一定の割合で保持し，Lys61のプロトン移動触媒としての機能を保証することが明らかになり，TSの反応特異性の全貌がほぼ明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成25年度までの後半部分の詳細な解析と合わせ，平成26年度の研究によってトレオニン合成酵素（TS）の反応機構のほぼ全体が明らかになった。しかしながら，若干の部分，すなわちエナミン中間体からPLP-アミノクロトン酸アルジミン中間体までの過程が1段階であるものの，まだ不明である。この解明には正常基質であるO-ホスホホモセリン（OPHS）とTSの反応の解析が不可欠である。しかしながらOPHSは入手が困難であり，化学合成もホモセリンのγ位の誘導体がホモセリンラクトンを形成しやすいことから極めて収率が悪いという難点がある。このために，エナミン中間体からPLP-アミノクロトン酸アルジミン中間体までの過程のみについてはまだ解析が完了していない。以上の理由により，当初の目的よりは若干遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年3月に開催された日本化学会第95春季年会において，アミノ酸誘導体の合成に実績を有する渡辺化学工業と懇談する機会を得，OPHSの合成について協力を得られることとなった。これによってOPHSとTSの反応の解析に道が拓かれ，最後に残った過程を解明する可能性が出てきた。
また，平成26年度の研究結果はまだ未発表であり，平成27年度中に成果発表を論文発表及び学会発表（Biocatalysis 2015およびPacifichem 2015）で行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究の中心的な対象であるトレオニン合成酵素の基質アナログは2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸をはじめとして非常に高価な化合物であるが，これを含めていくつかの基質及び基質アナログの合成に成功し，試薬代を大幅に節約することができた。その他節約に努めた。また，本研究において重要な化合物であるO-ホスホホモセリンが，合成の困難さのために得ることができず，これにかかると予想された試薬代に相当する分（約400千円程度）が使用されなかった。これらを合わせ，上記の余剰額が発生した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
「今後の研究の推進方策」に記載したとおり，O-ホスホホモセリンの購入のめどが立ったので，その購入にまず使用する。さらに昨年JACSに発表した，酵素反応と量子化学計算の融合的解析が海外で注目され，本年6月に開催されるBiocatalysis 2015（ロシア・モスクワ）での発表を要望され，また12月に開催される環太平洋国際化学会議（Pacifichem 2015，アメリカ・ホノルル）での招待講演を依頼されている。これらの旅費に当てる予定である。さらに平成27年度に成果を発表する予定であり，そのための投稿料等に使用する計画である。
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