| 研究課題/領域番号 |
24570219
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
中村 太郎 大阪市立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (30291082)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | シンタキシン / アレスチン / エンドサイトーシス / 酵母 |
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| 研究概要 |
分裂酵母の胞子形成は、減数分裂と同調し、細胞内に新たに細胞を形成する興味深い現象である。このとき、細胞膜のシンタキシン１オルソログPsy1はとりこまれ、胞子の細胞膜へと移行する。しかしながら、どのようなタンパク質がPsy1を特異的に認識し、とりこむかについては不明である。本研究は、そのキーであるアレスチン様タンパク質Mug170がいかにPsy1を認識し、減数分裂特異的なPsy1のエンドサイトーシスを引き起こすか、その分子メカニズムを明らかにすることを目的とする。
本年度は、まず、分子細胞生物学アプローチにより、Mug170の基本的な機能、性質を調べた。Mug170、Psy1や核タンパク質、各オルガネラ局在マーカータンパク質などをCFP, GFP, mCherryなど異なる蛍光タンパク質で標識し、さらにエンドサイトーシスを追跡できる蛍光試薬FM4-64なども含めたライブイメージング系を用いて解析をおこなった。Psy1が細胞膜からとりこまれる時には、Mug170も同じ場所にみられた。この他、Psy1のとりこみのダイナミクスを観察できた。
ユビキチン化に必要なリジン残基をアルギニンに置換した変異Psy1タンパク質（全部で12個あるが、そのすべておよび一部を置換したものを作製・解析）の一部はとりこみに欠損がみられたことから、ユビキチン化がPsy1の取り込みに必要なことが示唆された。しかしながら、Psy1のユビキチン化については、未だ検出には至っていない。また、分裂酵母に存在するHECT型ユビキチンリガーゼ（エンドサイトーシスに関わるユビキチンリガーゼ）7つのすべての破壊株を構築したが、Psy1の取り込みに影響が見られるものはなかった。この結果から複数のユビキチンリガーゼがPsy1のとりこみに関与している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
分子細胞生物学アプローチによるMug170の基本的な機能、性質については、ほぼ当初の目的通りに進行した。Mug170は栄養細胞及び減数分裂初期には発現がみられないが、第一減数分裂終了後から細胞膜にみられた。局在は細胞膜に均一ではなく、細胞膜の特定の場所に存在した。Psy1もこの時期に細胞膜に不均一に局在するが、その局在はMug170とほぼ一致した。
Psy1には12個のリジン残基が存在するが、それをアルギニンに置換したさまざまな変異株を作製した。作製した変異株の解析から、Psy1のユビキチン化が取り込みに必要な可能性が示唆された。さらに解析をすすめたところ、N末付近に存在する３つの近接するリジンがユビキチン化される可能性が示唆された。しかしながら、Psy1のユビキチン化の直接的な検出にはいたっていない。また、HECT型といわれるユビキチンリガーゼのすべての破壊株を作製したが、どの破壊株でもPsy1の取り込みは阻害されなかった。このことからPsy1のユビキチン化には複数のユビキチンリガーゼが関わる可能性が示唆された。
以上のことから、研究の予定は当初の計画通りおおむね順調に進行しているが、ユビキチン化の検出など、いくつか未解決のものもあった。
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| 今後の研究の推進方策 |
まず、平成24年度に解決できなかった点についてすすめていく。Psy1のユビキチン化の検出等、生化学的な実験をおこなう。リジンをアルギニンに置換した変異株では、ユビキチン化される可能性のあるリジン残基を3つまで絞り込んだ。今後はどのリジン残基が必要なのかを決定したい。また、Psy1のとりこみにかかわる因子については、分裂酵母の遺伝子破壊株コレクションを用いて、網羅的に調べていく。Psy1に対する抗体はすでに作製ずみである。減数分裂・胞子形成を誘導した後、経時的にPsy1を免疫沈降し、抗ユビキチン抗体で検出する。このユビキチン化の時期と、とりこみの時期の検証を行う。
Psy1とMug170の直接的な相互作用についても免疫沈降法によって調べていく。Mug170は遺伝学的にはPsy1と相互作用しているが、実際に物理的に相互作用しているかを免疫沈降実験により、明らかにする。アレスチンと標的タンパク質との結合は一時的なので、クロスリンカー等の使用も検討する。また、酵母ツーハイブリッド解析も行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
消耗品の購入を中心にすすめていく。分裂酵母の遺伝子破壊株コレクションが韓国の会社から販売されている。このコレクションを購入することを中心とする。また、免疫沈降法に必要な試薬等の購入も行う。
その他、研究うち合わせの旅費等の使用を予定している。
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