| 研究課題/領域番号 |
24580110
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 京都工芸繊維大学 |
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研究代表者 |
麻生 祐司 京都工芸繊維大学, 工芸科学研究科, 准教授 (70380590)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | アクリル酸 / 代謝工学 / 発酵工学 / バイオベースマテリアル |
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| 研究概要 |
アクリル酸生産野生株Megasphaera elsdenii JCM1772のゲノムシーケンスから、アクリル酸生産関連遺伝子（pct（プロピオン酸-CoA転移酵素遺伝子）およびlcdCAB（ラクチル-CoA脱水酵素遺伝子））を同定した。M. elsdenii JCM1772のゲノムを鋳型としてPCRによりpctおよびlcdCABを1つのオペロンとして増幅後、発現ベクターpTV118NにクローニングしpTV-pct-lcdCABを得た。これを用いてE. coli JW0885を形質転換しE. coli JW0885(pTV-pct-lcdCAB)を得た。また、pctおよびlcdCABをそれぞれpET system用発現ベクターpETHisにクローニングしpETHis-pctとpET-lcdCABを得た。これらを用いてE. coli JW0885(DE3)(pLysS)を形質転換しE. coli JW0885(DE3)(pETHis-pct, pLysS)およびE. coli JW0885(DE3)(pET-lcdCAB, pLysS)を得た。E. coli JW0885(pTV-pct-lcdCAB)を用いた場合、PctおよびLcdCABの明確な発現の確認はできなかったが、グルコースからのアクリル酸の生産を確認できた。このとき、培養液中のアクリル酸濃度は0.01 g/L、対糖収率は0.9%であった。よって、Pctがアクリル酸-CoA転移酵素として機能している可能性が示唆された。一方、E. coli JW0885(DE3)(pETHis-pct, pLysS)およびE. coli JW0885(DE3)(pET-lcdCAB, pLysS)を用いた場合、PctとLcdCABが高発現することを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画では、①pctおよびlcdAB遺伝子の機能解析、②PctおよびLcdAB酵素の機能解析、③アクリル酸-CoA転移酵素とアクリル酸トランスポーターの同定を達成する予定であった。このうち、①については、Megasphaera elsdenii JCM1772のゲノムシーケンスからpctおよびlcdAB遺伝子を同定し相同解析することである程度達成できた。②については、大腸菌でのPctおよびLcdCABの発現量が低く、実施に至っていない。③については、Pctがアクリル酸-CoA転移酵素として機能している可能性が示された一方で、アクリル酸トランスポーターの同定には至らなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
大腸菌でのPctおよびLcdCABの発現法を改良し発現量を増加させることでPctおよびLcdCABの機能解析を行うとともに、Megasphaera elsdenii JCM1772にTn変異を導入しアクリル酸トランスポーターの同定を行うことで、今年度に達成できなかった課題を解決する。また、今年度は当初の予定通り、アクリル酸生産関連遺伝子の乳酸高生産菌への導入と、バイオマス資化酵素の細胞表層ディスプレイを行い、アクリル酸生産性を高めるとともに、バイオマスからの直接発酵生産法の確立を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ほぼ計画通りに研究費を使用できた。しかし、一部の消耗品に関して、キャンペーン価格の商品があり、当初見積もりよりも安く購入することができたため、当該研究費が生じた。当該研究費は次年度に必要な大腸菌でのPctおよびLcdCABの発現量を高めるための新たな発現用ベクターの購入費に充てる。
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