| 研究実績の概要 |
これまでに、既報の微生物由来コレステロールオキシダーゼの中で、最も高い熱安定性、界面活性耐性、有機溶媒耐性を示すコレステロールオキシダーゼ （Chromobacterium sp.DS-1株由来）の探索、酵素学的諸性質の解析、遺伝子解析、立体構造の解析を行ってきた。本研究では、DS-1株由来コレステロールオキシダーゼの触媒機構を解明するため触媒活性に関与する部位を同定し、これらの知見を基にして、高安定かつ高活性な微生物由来コレステロールオキシダーゼを創製することを目的とした。コレステロールオキシダーゼの補酵素であるフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)近傍のアミノ酸が酵素の触媒活性や安定性に関与していることが考えられたため、部位特異的変異導入法によってFAD近傍のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異体酵素を作製し、変異体酵素の活性や安定性について調べた。DS-1株由来コレステロールオキシダーゼの立体構造から、W22, W65, P128, P130, H144などが、FAD近傍に存在することが示されていた。分子シミュレーション解析によりP130やH144を他のアミノ酸に置換すると安定性が向上する可能性が示唆されたため、これら変異体酵素発現用プラスミドも作製した。これらのプラスミドを、大腸菌に導入し、調製した菌体破砕液を用いて、陰イオン交換クロマトグラフィーなどにより、コレステロールオキシダーゼを精製した。精製した変異体酵素の安定性や反応速度論的解析を行った。この結果、作製した変異体酵素は野生型に比べて安定化することが分かった。
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