研究課題
基盤研究(C)
目的：我々はコイのCD4+T細胞（Th細胞）が単クローン性に増殖できる培養系を確立しており、これまでに哺乳類のTｈ亜集団の1つであるTh2様のクローンを得ている。そこで本研究では、さらに多くのクローンを作製し、それらの性状を解析することで、魚類Th亜集団の探索を試みた。方法：支持細胞層を形成させた25cm²フラスコ上で、コイ腎臓白血球を20%FBS及び2.5%コイ血清を添加したE-RDF培地で培養した（バルク培養）。これにより増殖した細胞を顕微鏡下で１細胞ずつ分取し、支持細胞層を形成させた96穴プレートの各穴に1細胞ずつ播種した。これらの1細胞からコロニーを形成させ、さらに拡大培養を行った。なお、培養液にはバルク培養の上清と、T細胞増殖因子であるコイIL-2のリコンビナントタンパク（ｒIL2）を作製し、添加した。結果：上述の培養系でｒIL2を添加したところ、無添加の場合と比べ、コロニーが形成されたウェル数が約2倍に上昇した。得られたT細胞クローンを継代したところ、3つのクローンにおいて長期培養が可能となった(クローンNo.1, No.2, No.3)。これらのクローンはTCR-α, -β, 及びCD4-1の発現が見られたが、CD4-2, CD8α及びCD8βの発現は見られなかった。次に、各クローンをT細胞マイトジェンであるPHAで刺激し、刺激後に発現量が上昇するTh関連サイトカイン遺伝子を調べたところ、クローンNo.1では魚類のTh2サイトカインであるIL-4/13A及びIL-4/13Bの発現上昇が見られたが、クローンNo.2ではTh1サイトカインであるINFgの発現上昇が見られた。以上のことから、魚類においてもTh1およびTh2亜集団が存在することが示唆された。
2: おおむね順調に進展している
真骨魚類は，哺乳類と同様，T・B細胞を主体とした獲得免疫機構を持つ．そのため獲得免疫反応の中心的な制御機構を構成するTh亜集団の存在や性状を調べることは，魚病の病態解明・予防・ワクチン開発などに大きく貢献するものと思われる．このような背景から，近年魚類でも，Th亜集団の同定に向けた多くの研究が行われて来ている．しかし，その多くは，哺乳類遺伝子との相同性に基づく，魚類Th関連遺伝子の単離と，臓器・組織レベルの発現解析によるものであり，魚類Th亜集団の存在を直接証明していない．また，最近では，Th表面マーカー遺伝子の組換えタンパク質の合成と，それに対する抗体を作製し，哺乳類のTreg類似の集団をミドリフグで分離できたとの報告もある．しかし，この手法も，アイソフォーム遺伝子の多い魚類では，抗体の特異性が問題となったり，また，魚類に特有のTh亜集団を見逃したりする可能性もある．一方，我々が行うクローン化T細胞株の作製技術は，1個のTh細胞から増幅させるため，細胞の均一性は完全に担保される．また，哺乳類には無い，魚類特有のTh亜集団も発見できる可能もある．この様に，申請者らの取組みは，従来の研究手法と一線を隔すものであり，いままでにない，新たな発見が期待できる．
Th亜集団の同定には，Th1サイトカイン（IFNγ2・TNFα），Th2サイトカイン（IL4/13A，IL4/13B，IL10），Th17サイトカイン（IL17，IL22）およびTregサイトカイン（TGFβ，IL10）などの発現解析を各細胞株について行なう必要がある．また，哺乳類Th亜集団のそれぞれの分化や機能維持には，特異的な転写因子の発現が重要である．すなわち，Th1，Th2，Th17およびTregにはそれぞれ，T-bet，GATA3，RORγtおよびFoxP3が発現していると考えられる．そこで，これら転写因子遺伝子についても，各細胞株で発現の有無を調べ，サイトカイン産生パターンと合わせて，Th亜集団の同定を行う．
該当なし．
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Fisheries science
巻: 79 ページ: 213-220
10.1007/s12562-012-0590-5
Fish & Shellfish Immunology
巻: 34(2) ページ: 433-442
10.1016/j.fsi.2012.11.005
http://hp.brs.nihon-u.ac.jp/~vetfish/start.htm
