| 研究課題/領域番号 |
24580291
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 独立行政法人水産総合研究センター |
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研究代表者 |
松山 知正 独立行政法人水産総合研究センター, 増養殖研究所, 主任研究員 (20372021)
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| 研究分担者 |
中易 千早 独立行政法人水産総合研究センター, 増養殖研究所, グループ長 (00311225)
安池 元重 独立行政法人水産総合研究センター, 中央水産研究所, 研究員 (20604820)
藤原 篤志 独立行政法人水産総合研究センター, 中央水産研究所, 研究員 (30443352)
高野 倫一 独立行政法人水産総合研究センター, 増養殖研究所, 研究員 (40533998)
中村 洋路 独立行政法人水産総合研究センター, 中央水産研究所, 研究員 (90463182)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | アコヤガイ赤変病 / メタゲノム |
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| 研究概要 |
赤変病を発症したアコヤガイ（病貝）血リンパ液の超遠心沈査（2万×g, 60分）を解析サンプルに用いた。当分画に病原体が含まれることは、感染履歴のないアコヤガイ（健常貝）への感染試験により確認した。
超遠心沈査から抽出される極めて微量のDNAを増幅する手法を検討し、DNAを断片化した後、両端にアダプターを結合し、アダプター特異的なプライマーでPCR法で増幅することにより、偏りが少なく効率の良い増幅が可能なことを明らかにした。超遠心沈査より抽出したDNAには、アコヤガイや餌料生物である珪藻由来のゲノムが多量に含まれていた。珪藻由来のゲノムは、サンプリング前の数日間を絶食することでサンプルへの混入を低減できた。混入するアコヤガイ由来のゲノムは、以下の方法で除去した。アダプターを連結した超遠心沈査由来DNAに対し、健常貝の組織より抽出した過剰量の断片化DNAを加え、加熱処理してDNAを解離させた後に徐々に冷却することで再結合させ、Duplex-specific nucleaseにより二本鎖DNAを特異的に消化した。DNAを精製し、アダプター配列に特異的なプライマーを用いて、消化されなかった一本鎖DNAを再増幅した。
超遠心沈査から抽出したRNAには、アコヤガイ由来のリボソームRNA（rRNA)が多量に含まれていた。市販のrRNA除去キットではアコヤガイｒRNAを除去出来なかったため、ｒRNAの配列に相補的なビオチン化RNAを用いた除去方を検討し、効率の良い条件を確立した。rRNAを除去した後、whole transcriptome amplification kitを用いてcDNAを増幅した。
現在、以上により増幅した核酸を次世代シーケンサーにより解析している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画通りに次世代シーケンサーを用いたメタゲノム解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
大規模シーケンス解析で得られた配列からDNAマクロアレイを作製し、病貝に特異的な配列を探索する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
主にDNAマイクロアレイの作製と、蛍光標識試薬、ハイブリダイゼーション試薬に使用する。
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