| 研究課題/領域番号 |
24580293
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
田中 啓之 北海道大学, 水産科学研究科(研究院), 助教 (90241372)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 筋肉 / 筋収縮調節 / トロポニン / トロポミオシン / ミオシン / ミオシンフィラメント / アクチンフィラメント / 棘皮動物 |
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| 研究概要 |
アメリカムラサキウニ・ゲノムデータベースの情報に基づくRT-PCRによって、キタムラサキウニ顎骨間筋に、筋収縮調節タンパク質であるトロポニンT(TnT)およびトロポニンI(TnI)の他、アクチンの遺伝子が発現していることを確認した。特に、TnIに関しては、翻訳領域の630塩基の配列を決定し、N端側に軟体動物と同様に大きな伸長領域が存在する一方、C端側は他に類を見ないほど短縮し、トロポニンC(TnC)結合部位を欠く、などの特徴が明らかとなった。一方、顎骨間筋からアクトミオシンを抽出し、SDS-PAGEと質量分析で主要な構成タンパク質を分析した結果、ミオシン重鎖および軽鎖、パラミオシン、アクチン、トロポミオシン、カルポニンの他、芳香族アミノ酸に富んだ未同定タンパク質が確認された。しかし、TnIおよびTnTは確認されなかった。以上の結果から、顎骨間筋において、トロポニンは発現しているものの発現量は少ないと考えられた。
また、マナマコ体壁縦走筋を低塩濃度緩衝液でホモジナイズ・洗浄して筋原繊維を調製したが、これは、パラミオシンとミオシンを主成分とし、アクチンをほとんど含んでいなかった。また、縦走筋を高塩濃度の緩衝液でホモジナイズすると、アクトミオシンが抽出されたが、その塩濃度を低下させると、かなりのアクチンフィラメントが沈殿せずに上清に残存した。これらの結果は、マナマコのアクチンフィラメントとミオシンフィラメントの相互作用が、他動物に比べて弱いことを示唆している。得られたマナマコ・アクトミオシンはわずかなCa-ATPase活性を示したが、Mg-ATPase活性は皆無だった。また、アクチンフィラメントは、ウサギミオシンに加えても全くMg-ATPase活性を促進しなかった。従って、アクチンフィラメントには、アクチンの筋収縮活性化作用を阻害する因子が付随していると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
キタムラサキウニ顎骨間筋にトロポニンが発現していることを確認し、トロポニンIについてはcDNAクローニングも行えたが、その発現量は少ないと考えられた。他の組織や幼生の各体部における発現分布を解析する予定だったが、実施できなかった。また、クローニングしたcDNAからトロポニンIの大腸菌発現を行い、脊椎動物や他の無脊椎動物のトロポニンIと機能を比較するとともに、抗血清を作成する予定だったが、これも達成できていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
キタムラサキウニ顎骨間筋から、RT-PCRにより、トロポニンI、トロポニンTおよびトロポミオシンの全長をコードするcDNAのクローニングを行う。また、それらの大腸菌発現系構築を進め、発現タンパク質の機能を、これまで我々が調べてきた脊椎動物、軟体動物、並びに節足動物のものと比較する。特にトロポニンIについては、トロポニンC結合部位が欠落するとともに、収縮阻害部位（アクチン結合部位）のアミノ酸配列に他に類を見ない特徴があることから、これらのタンパク質に対する相互作用に特徴を見出し、収縮調節の分子機構に関しての知見を得たい。また、発現タンパク質をウサギに免疫して抗血清を作成し、様々な棘皮動物にトロポニンによる収縮調節系が存在しているかどうか、ウェスタンブロッティングや免疫組織化学的検討によって明らかにする。特に、キタムラサキウニまたはエゾバフンウニの発生実験により、プルテウス幼生や稚ウニを培養し、トロポニンの存在部位を検討する。一方、マナマコ体壁縦走筋に関しては、筋原繊維やアクトミオシンの性質が特異であり、アクチンフィラメントとミオシンフィラメントを分離することが容易であることから、それぞれを単離し、別途調製した脊椎動物や軟体動物のアクチンおよびミオシンフィラメントとハイブリッドさせて、Mg-ATPase活性のCa2+依存性を測定するなどして、収縮のCa2+調節機構がミオシンフィラメントまたはアクチンフィラメントのいずれに存在するかの検討を行う。また、マナマコの両フィラメントには、筋収縮を抑制状態に維持し、エネルギーの消費を抑える機構の存在が示唆されることから、収縮抑制因子の同定を試みる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
次年度使用額（9,081円）に関しては、物品費（消耗品購入）として、翌年度以降に請求する経費と合わせ、研究計画の遂行のために使用する。
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