選択用薬剤に依存しない遺伝子高発現細胞取得に基づく異種移植用クローンブタの作製

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24580411
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 佐藤 正宏 鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 教授 (30287099)
• 研究分担者: 三好 和睦 鹿児島大学, 農学部, 准教授 (70363611)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 異種移植拒絶関連遺伝子 / ブタ細胞 / α-Galエピトープ / 体細胞核移植 / EndoGalC / CD47 / DAF / トロンボモジュリン

研究概要

ブタからヒトへの異種移植には、移植時、超急性移植拒絶（HAR）を招く特定の糖鎖α-Gal（αガラクトース）エピトープをブタ細胞表面から除く必要がある。しかし、それだけでは足りず、HAR後に起こる急性、慢性移植拒絶を抑えるため、多遺伝子が導入された異種移植用多遺伝子導入クローンブタの開発が求められる。今回、独自に考案した選択用薬剤に依存しない多遺伝子同時高発現細胞の取得法と体細胞核移植法（SCNT）を駆使することにより、SCNT率を高め、その結果として、繁殖性の良好な極力移植拒絶を抑えた上記クローンブタの開発を目指す。
平成24年度は、IB4-SAP（α-Galエピトープを特異的に識別、結合するレクチンであるIB4にサポリン毒素が結合したもの）を用いて薬剤耐性遺伝子不在下で遺伝子高発現ブタ細胞の単離が可能かどうかについて検討した。
先ず、α-Galエピトープを消化できるEndoGalCをコードする遺伝子と緑蛍光タンパクをコードするEGFP cDNAを同時発現できるプラスミドベクターpCEIEndを構築する。このベクターをブタ胎仔性繊維芽細胞に遺伝子導入し、遺伝子導入後4-5日目（ベクターが細胞ゲノムに挿入された時期）細胞をトリプシン処理で回収する。次いで、これら細胞をIB4-SAPを含む液に懸濁し、3 h, 37℃にて加温する。その後、細胞懸濁液をそのまま新鮮培地を含む培養皿に入れ、10日間ほど培養する。
この過程で、IB4-SAPと結合した細胞（α-Galエピトープを発現）は死滅し、結合しなかった細胞（α-Galエピトープを発現しない；EndoGalC、EGFPが過剰に発現されていると目される）は生存し、強い緑蛍光を示すコロニーとなって増殖する。
この実験を通し、EndoGalC/EGFP高発現とα-Galエピトープ発現減退という逆相関性を明らかにする。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予想通り、EndoGalCが強発現されると、ブタ細胞表面のα-Galエピトープ発現は消失した。同時に、α-Galエピトープ発現を消失した細胞では、目的タンパクと奉じたEGFPの強い発現が認められた。これは、EndoGalC/EGFP高発現とα-Galエピトープ発現減退という逆相関性を意味するもので、既出の仮説が証明できた（この点は今年論文として出版することができた。Sato　M, Akasaka E, Saitoh I, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S: Targeted toxin-based selectable drug-free enrichment of mammalian cells with high transgene expression. Biology 2013, 2, 341-355）。
次に、「異種移植関連遺伝子を複数個内蔵する発現ベクターの構築と同ベクターとIB4-SAPとを用いて薬剤耐性遺伝子不在下で複数個の遺伝子の高発現がブタ細胞で可能かどうかについての検討」を行なうため、現在、異種移植関連遺伝子を内蔵したベクター系を構築している。

今後の研究の推進方策

異種移植関連遺伝子としてCD47抗原遺伝子（急性移植拒絶を抑えるタンパクをコード）、DAF遺伝子（急性移植拒絶を抑えるタンパクをコード）、TM遺伝子（慢性移植拒絶を抑えるタンパクをコード）をブタ細胞ゲノムに挿入することを考えている。なお、EndoGalC発現によるブタ細胞表面のα-Galエピトープ発現消失は、超急性移植拒絶を抑えるために必須の項目である。
これらの遺伝子を同時導入されたブタ細胞を作製する。
最終的に生存した細胞コロニーを拾い、CD47抗原、DAF、TMの蛋白が発現されているかをそれぞれの抗体を用いて、免疫細胞化学的に検討する。期待される細胞は、異種移植関連遺伝子としてCD47抗原遺伝子（急性移植拒絶を抑えるタンパクをコード）、DAF遺伝子（急性移植拒絶を抑えるタンパクをコード）、TM遺伝子（慢性移植拒絶を抑えるタンパクをコード）をブタ細胞ゲノムに挿入することを考えている。なお、EndoGalC発現によるブタ細胞表面のα-Galエピトープ発現消失は、超急性移植拒絶を抑えるために必須の項目である。
これらの遺伝子を同時導入されたブタ細胞を作製する。
最終的に生存した細胞コロニーを拾い、CD47抗原、DAF、TMの蛋白が発現されているかをそれぞれの抗体を用いて、免疫細胞化学的に検討する。期待される細胞は、α-Galエピトープ陰性、CD47陽性、DAF陽性、TM陽性となる。α-Galエピトープ陰性、CD47陽性、DAF陽性、TM陽性となる。

次年度の研究費の使用計画

消耗品費：遺伝子工学実験、細胞工学実験、動物購入等の消耗品は、本研究遂行上必須である。
旅 費：国内の各種学会への発表・参加するための旅費と資料収集のための旅費も計上している。
謝金、その他：免疫組織化学、RT-PCR解析等は、その経験がある他の学外共同研究者に補助をお願いする予定である。また、論文作製のため論文の校閲とジャーナルへの論文投稿費を計上している。

研究成果

• [雑誌論文] Development of a technique for efficient gene transfer to antral follicular cells in the mouse ovary (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Akasaka E, Saitoh I, Ohtsuka M, Watanabe S
  • 雑誌名: Systems Biology in Reproductive Medicine 巻: 58, ページ: 136-141
  • DOI: 10.3109/19396368.2012.656796.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted transgenesis through pronuclear injection of improved vectors into in vitro fertilized eggs (2012)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuka M, Miura H, Nakaoka H, Kimura M, Sato M, Inoko H
  • 雑誌名: Transgenic Research 巻: 21 ページ: 225-226
  • DOI: 10.1007/s11248-011-9505-y.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression analysis of a α-1, 3-galactosyltransferase, an enzyme that creates xenotransplantation-related α-Gal epitope, in pig preimplantation embryos (2012)
  • 著者名/発表者名: Chi H, Sato M, Yoshida M, Miyoshi K
  • 雑誌名: Animal Science Journal 巻: 83 ページ: 88-93
  • DOI: 10.1111/j.1740-0929.2011.00964.x.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Successful suppression of endogenous α-1,3-galactosyltransferase expression by RNA interference in pig embryos generated in vitro (2012)
  • 著者名/発表者名: Chi H., Shinohara M., Yokomine T., Sato M., Takao S., Yoshida M., Miyoshi K
  • 雑誌名: Journal of Reproduction and Development 巻: 58 ページ: 69-76
  • DOI: 10.1262/jrd.10-165M
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vivo gene transfer in mouse preimplantation embryos after intraoviductal injection of plasmid DNA and subsequent in vivo electroporation (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Akasaka E, Saitoh I, Ohtsuka M, Watanabe S
  • 雑誌名: Systems Biology in Reproductive Medicine 巻: 58 ページ: 278-287
  • DOI: 10.3109/19396368.2012.688088.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Determination of the optimal concentration of several selective drugs useful for generating multi-transgenic porcine embryonic fibroblasts (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Ohtsuka M, Miura H, Miyoshi K, Watanabe S
  • 雑誌名: Reproduction in Domestic Animals 巻: 47 ページ: 759-765
  • DOI: 10.1111/j.1439-0531.2011.01964.x.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Cre knock-in mouse line on the Sickle tail locus induces recombination in the notochord and intervertebral disks (2012)
  • 著者名/発表者名: Abe K, Araki K, Tanigawa M, Semba K, Ando T, Sato M, Sakai D, Hiyama A, Mochida J, Yamamura K-I
  • 雑誌名: Genesis 巻: 50 ページ: 758-765
  • DOI: 10.1002/dvg.22035.
  • 査読あり
• [雑誌論文] CD81 and CD9 work independently as extracellular components upon fusion of sperm and oocyte (2012)
  • 著者名/発表者名: Ohnami N, Nakamura A, Miyado M, Sato M, Kawano N, Yoshida K, Harada Y, Takezawa Y, Kanai S, Ono C, Takahashi Y, Kimura K, Shida T, Miyado K, Umezawa A
  • 雑誌名: Biology Open 巻: 1 ページ: 640-647
  • DOI: 10.1242/bio.20121420.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A simplified protocol for the semi-large scale recovery of plasmids from Escherichia coli grown on agar plates (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Akasaka E, Saitoh I, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S
  • 雑誌名: Journal of Biomedical Science and Engineering 巻: 5 ページ: 406-408
  • DOI: 10.4236/jbise.2012.57051
  • 査読あり
• [雑誌論文] Generation of a set of mouse STO feeder cell lines that confer resistance to several types of selective drugs (2012)
  • 著者名/発表者名: Saitoh I, Sato M, Iwase Y, Akasaka E, Yamasaki Y, Noguchi H
  • 雑誌名: Cell Medicine (Part B of Cell Transplantation) 巻: 3 ページ: 97-102(6)
  • DOI: 10.3727/215517912X639414
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fluorescent transgenic mice suitable for multi-color aggregation chimera studies (2012)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuka M, Miura H, Gurumurthy CB, Kimura M, Inoko H, Yoshimura S, Sato M
  • 雑誌名: Cell and Tissue Research 巻: 350 ページ: 251-260
  • DOI: 10.1007/s00441-012-1470-0.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Attenuation of limb loss in an experimentally induced hindlimb ischemic model by FGF-2/ F/P MPs as a delivery system (2012)
  • 著者名/発表者名: Nakamura N, Ishihara M, Takikawa M, Kishimoto S, Isoda S, Fujita M, Sato M, Maehara T
  • 雑誌名: Tissue Engineering (Part A) 巻: 18 ページ: 2239-2247
  • DOI: 10.1089/ten.TEA.2011.0741.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Delivery system for autologous growth factors fabricated with low-molecular-weight heparin and protamine to attenuate ischemic hindlimb loss (2012)
  • 著者名/発表者名: Nakamura S, Takikawa M, Ishihara M, Nakayama T, Kishimoto S, Isoda S, Ozeki Y, Sato M, Maehara T
  • 雑誌名: Journal of Artificial Organs 巻: 15 ページ: 375-385
  • DOI: 10.1007/s10047-012-0658-0.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Functional recovery of a whole ovary transplanted into syngenic testis in mice (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S, Yasuoka Y
  • 雑誌名: Cloning & Transgenesis 巻: 1 ページ: 102
  • DOI: 10.4172/2168-9849.1000102
  • 査読あり
• [学会発表] PITT法を利用して作製したノックダウンマウスにおけるノックダウン効果の比較解析 (2012)
  • 著者名/発表者名: 三浦浩美、佐藤正宏、大塚正人
  • 学会等名: 第35回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 国際会議場・マリンメッセ福岡(福岡市)
  • 年月日: 20121211-20121214
• [学会発表] ヒトEndo-β-N-acetylglucosaminidase遺伝子を用いた新たなCancer vaccination法の開発 (2012)
  • 著者名/発表者名: 渡部聡、原口清輝、中村伸吾、桜井敬之、梶原景正、麦倉信一郎、佐藤正宏
  • 学会等名: 第35回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 国際会議場・マリンメッセ福岡(福岡市)
  • 年月日: 20121211-20121214
• [学会発表] マウス肝臓を標的としたplasmid DNAの効率的な遺伝子導入法の開発 (2012)
  • 著者名/発表者名: 中村伸吾、前原正明、渡部聡、石原雅之、佐藤正宏
  • 学会等名: 第35回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 国際会議場・マリンメッセ福岡(福岡市)
  • 年月日: 20121211-20121214
• [学会発表] マウス成熟卵胞細胞への生体内遺伝子導入法の開発 (2012)
  • 著者名/発表者名: 佐藤正宏、赤坂恵理、齋藤一誠、大塚正人、渡部聡
  • 学会等名: 第35回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 国際会議場・マリンメッセ福岡(福岡市)
  • 年月日: 20121211-20121214
• [学会発表] ENDOGALC/TARGETED TOXIN-BASED SELECTION SYSTEM AS A USEFUL TOOL FOR ENRICHMENT OF TRANSGENE-HIGH-EXPRESSING MAMMALIAN CELLS (2012)
  • 著者名/発表者名: Sato M, Akasaka E, Saitoh I, Ohtsuka M, Nakamura S, Sakurai T, Watanabe S
  • 学会等名: 9th Asian Reproductive Biotechnology Society (ARBS) conference
  • 発表場所: Edsa Shangri-La Hotel, Mandaluyong City, Manila, Phillipine
  • 年月日: 20121023-20121028
• [学会発表] Sktcreマウス系統を用いた椎間板コンディショナルノックアウトシステムの構築 (2012)
  • 著者名/発表者名: 阿部幸一郎、荒木喜美、谷河麻耶、仙波圭、安藤卓、佐藤正宏、酒井大輔、檜山明彦、持田譲治、山村研一
  • 学会等名: 第59回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: 別府国際コンベンションセンター（大分市）
  • 年月日: 20120524-20120526
• [学会発表] プラスミドDNAの卵管内注入、続く電気穿孔法によるマウス着床前胚への遺伝子導入法の開発 (2012)
  • 著者名/発表者名: 佐藤正宏、赤坂恵理、齋藤一誠、大塚正人、渡部聡
  • 学会等名: 第59回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: 別府国際コンベンションセンター（大分市）
  • 年月日: 20120524-20120526
• [学会発表] 胎児及び新生児精巣の成熟精巣への移植によるspermatogenesisの誘導 (2012)
  • 著者名/発表者名: 多田昇弘、金井富三夫、中村衣里、魯紅梅、齋藤正輝、佐藤正宏
  • 学会等名: 第59回日本実験動物学会総会
  • 発表場所: 別府国際コンベンションセンター（大分市）
  • 年月日: 20120524-20120526